桃葉珊瑚苷對腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對腫瘤壞死因子α的影響研究

劉秋庭，姚靚，涂鄂文，譚莉，李曉輝，王照

·論著·

桃葉珊瑚苷對腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對腫瘤壞死因子α的影響研究

劉秋庭，姚靚，涂鄂文，譚莉，李曉輝，王照

目的探討桃葉珊瑚苷(AU)對腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對腫瘤壞死因子α(TNF－α)的影響。方法將90只健康SD大鼠隨機分成假手術(shù)組、腦出血組、AU治療組，每組30只。腦出血組及AU治療組大鼠于尾殼核區(qū)注入自體非肝素抗凝動脈血，建立腦出血動物模型，假手術(shù)組于相同部位注入0.9%氯化鈉溶液。造模成功后，AU治療組于術(shù)后6 h給予AU腹腔注射，腦出血組在相同時間給予相同劑量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。各組分別在造模后12 h、2 d、3 d、5 d、7 d取6只大鼠，參照Longa 5級評分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分、采用HE染色并計算血腫周圍腦組織白細(xì)胞數(shù)目、采用免疫組化法檢測血腫周圍腦組織中TNF－α表達(dá)情況。結(jié)果AU治療組和腦出血組大鼠造模后12 h神經(jīng)功能缺損評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);AU治療組大鼠造模后2 d、3 d、5 d、7 d神經(jīng)功能缺損評分低于腦出血組(P＜0.05)。腦出血組大鼠造模后12 h、2 d、3 d、5 d、7d血腫周圍腦組織中白細(xì)胞數(shù)目和TNF－α陽性細(xì)胞數(shù)多于AU治療組，AU治療組多于假手術(shù)組(P＜0.05)。結(jié)論AU對腦出血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機制可能與抑制血腫周圍腦組織TNF－α的表達(dá)有關(guān)。

腦出血;桃葉珊瑚苷;神經(jīng)保護(hù);腫瘤壞死因子;大鼠

劉秋庭，姚靚，涂鄂文，等.桃葉珊瑚苷對腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對腫瘤壞死因子α的影響研究［J］.實用心腦肺血管病雜志，2015，23(3):34－37.［www.syxnf.net］

Liu QT，Yao J，Tu EW，et al.Neuroprotective effect of Aucubin and its impact on TNF－α in rats with cerebral hemorrhage［J］.Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(3):34－37.

腦出血(intracerebral hemorrhage)是神經(jīng)內(nèi)科的多發(fā)病和常見病，具有病死率高及致殘率高等特點。腦出血急性期腦組織發(fā)生一系列病理生理變化，其中炎性反應(yīng)在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮了重要作用［1］。吳玉強等［2］研究顯示，腦出血過程中血漿腫瘤壞死因子α (TNF－α)水平與出血量呈正相關(guān)，出血量越大血漿TNF－α水平增高越明顯。桃葉珊瑚苷(aucubin，AU)屬于環(huán)烯醚萜苷類，是杜仲、車前草、地黃等中草藥的有效成分之一，其藥理作用較廣泛［3］，能抑制由抗原刺激產(chǎn)生的TNF－α和白介素6(IL－6)的基因表達(dá)與蛋白質(zhì)合成［4］。本研究通過觀察腦出血大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分、血腫周圍腦組織中白細(xì)胞數(shù)目和TNF－α表達(dá)情況，旨在探討AU對腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對TNF－α的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑健康雄性SD大鼠90只，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，體質(zhì)量為250～270 g。AU購于四川維克奇生物科技有限公司;免抗大鼠TNF－α免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物試劑公司;通用型二抗免疫組化試劑盒購于北京中山金橋生物試劑公司。

1.2 分組及試驗方法將90只SD大鼠隨機分成假手術(shù)組、腦出血組、AU治療組，每組30只。AU治療組于造模后6 h給予AU 4.2 mg/kg［5］，腹腔注射，1次/d;假手術(shù)組和腦出血組在同樣時間給予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液，腹腔注射，1次/d。各組分別在造模后12 h、2 d、3 d、5 d、7 d隨機選取6只大鼠，評價神經(jīng)功能缺損評分、測定血腫周圍組織中白細(xì)胞數(shù)目和TNF－α表達(dá)情況。

1.3 模型制備腦出血組和AU治療組參照Rosenberg等報道的方法制備大鼠腦出血模型。采用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，將大鼠俯臥位固定在立體定位儀上，調(diào)節(jié)門齒托的高度，使大鼠前、后囟處于同一水平，沿頭皮正中切一長10 mm切口，無菌操作暴露前囟，于前囟前0.2 mm，中線向右旁開3 mm處鉆一直徑為0.5 mm的小孔，進(jìn)針深度為5.5 mm(即尾殼核位置)。取大鼠尾靜脈自體不凝血50 μl，用微量進(jìn)樣器在8～10 min內(nèi)緩慢、多次、少量注入，注血結(jié)束留針10 min后緩慢退針，局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。假手術(shù)組于相同部位注入等量無菌0.9%氯化鈉溶液。以術(shù)后見明顯肢體癱瘓，大鼠腦切片中有明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則形的血腫存在為腦出血模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)，不符合以上標(biāo)準(zhǔn)及死亡者剔除。所有操作在無菌條件下進(jìn)行，術(shù)畢將大鼠放回籠中飼養(yǎng)，自由活動，禁食禁水。

1.4 觀察指標(biāo)評定腦出血組和AU治療組大鼠造模后不同時間點神經(jīng)功能缺損評分;觀察3組大鼠造模后不同時間點血腫周圍腦組織中白細(xì)胞數(shù)目和TNF－α表達(dá)情況。

1.4.1 神經(jīng)功能缺損評分腦出血組、AU治療組參照Longa 5級評分法［5］對神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評分，0級:無體征，計0分;1級:動物不能完全伸直其前肢，計1分;2級:動物一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象，計2分;3級:動物不能站立或打滾，計3分;4級:無自發(fā)性活動，有意識障礙，計4分。

1.4.2 標(biāo)本選取及病理切片制作造模成功大鼠，在12 h、2 d、3 d、5 d、7 d經(jīng)水合氯醛深度麻醉滿意后，于劍突下橫切口，沿膈肌與胸廓交界處剪開膈肌，暴露心臟，于心尖向上進(jìn)針，插入升主動脈，固定針頭，剪開右心耳，快速滴入37℃0.9%氯化鈉溶液100 ml，至右心耳流出液體變清亮，后用4℃的多聚甲醛(0.1 mmol/L PBS配制，pH值7.2～7.4)灌注(10 ml/ min)，先快后慢，約250 ml。斷頭開顱取全腦，去除嗅腦、小腦和低位腦干，將腦組織置于4%多聚甲醛中固定48 h。以穿刺點為中心分別向前、后各移1.0 mm，將腦組織冠狀切開，修成包含出血區(qū)及周邊區(qū)的4 mm長、厚約2 mm的腦片，常規(guī)石蠟包埋，然后在切片機上連續(xù)切片，片厚2 μm，行免疫組化染色和HE染色。

1.4.3 HE染色測定血腫周圍腦組織中白細(xì)胞數(shù)目切片脫蠟至水，放入蘇木精水溶液染色數(shù)分鐘，之后放入酸水及氨水中分色數(shù)秒鐘，流水沖洗1 h入蒸餾水片刻，入70%和90%乙醇中脫水各10 min，入乙醇伊紅染色液染色2～3 min，樹膠蓋玻片封固。在400倍視野下，用計算機圖像分析系統(tǒng)軟件隨機觀察并計數(shù)血腫周圍4個不重復(fù)視野的白細(xì)胞數(shù)目，取其平均值。

1.4.4 免疫組化染色檢測血腫周圍腦組織中TNF－α的表達(dá)切片常規(guī)脫蠟至水，0.01M枸櫞酸鈉緩沖液微波修復(fù)10 min;滴加一抗，4℃過夜，PBS漂洗2 min× 3次;加二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗2 min×3次;DAB顯色，中性樹膠封片。TNF－α免疫組化染色著色于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，免疫組化陽性細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜可見棕黃色顆粒，細(xì)胞無色或淡黃色為陰性。在400倍視野下，用計算機圖像分析系統(tǒng)軟件隨機觀察并計數(shù)血腫周圍4個不重復(fù)視野的TNF－α陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗;兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦出血組和AU治療組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比

較兩組大鼠造模后12 h神經(jīng)功能缺損評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);AU治療組大鼠造模后2 d、3 d、5 d、7 d神經(jīng)功能缺損評分低于腦出血組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。兩組大鼠神經(jīng)功能缺損程度呈先嚴(yán)重后減輕趨勢，造模3 d時最為嚴(yán)重(見表1)。

表1 兩組大鼠造模后不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較(±s，分)Table 1 Comparison of neural function defect score between the two groups of rats at different time points after modeling

表1 兩組大鼠造模后不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較(±s，分)Table 1 Comparison of neural function defect score between the two groups of rats at different time points after modeling

62.6±0.33.1±0.33.8±0.72.8±0.51.8±0.3 AU治療組62.3±0.42.5±0.63.1±0.32.0±0.60.8±0.5 t 12 h2 d3 d5 d7 d腦出血組組別只數(shù)1.4702.1912.2512.5104.201 P值值0.1420.0280.0240.0120.000

2.2 3組大鼠血腫周圍腦組織中白細(xì)胞數(shù)目比較3組大鼠造模后12 h、2 d、3 d、5 d、7 d血腫周圍腦組織中白細(xì)胞數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其中腦出血組大鼠造模后12 h、2 d、3 d、5 d、7 d血腫周圍腦組織中白細(xì)胞數(shù)目高于AU治療組，AU治療組大鼠高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。假手術(shù)組僅見少許白細(xì)胞浸潤，而腦出血組和AU治療組在造模后12 h病灶周圍即有明顯白細(xì)胞浸潤，造模后3 d達(dá)高峰，見表2。

表2 3組大鼠造模后不同時間點血腫周圍腦組織中白細(xì)胞數(shù)目比較(±s，個)Table 2 Comparison of WBC count in brain tissue around hematoma among 3 groups of rats at different time points after modeling

表2 3組大鼠造模后不同時間點血腫周圍腦組織中白細(xì)胞數(shù)目比較(±s，個)Table 2 Comparison of WBC count in brain tissue around hematoma among 3 groups of rats at different time points after modeling

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與腦出血組比較，△P＜0.05

組別只數(shù)65.0±0.55.0±0.56.0±0.65.0±0.65.0±0.6腦出血組612.0±0.8*18.0±1.6*40.0±3.6*26.0±2.8*10.0±2.7*AU治療組68.0±0.6＊△12.0±0.4＊△32.0±3.3＊△16.0±2.1＊△6.0±2.5＊△F 12 h2 d3 d5 d7 d假手術(shù)組177.6256.6331.2650.324.51 P值值0.000.000.000.000.00

2.3 3組大鼠血腫周圍腦組織中TNF－α陽性細(xì)胞數(shù)比較3組大鼠造模后12 h、2 d、3 d、5 d、7 d血腫周圍腦組織中TNF－α陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其中腦出血組大鼠血腫周圍腦組織中TNF－α陽性細(xì)胞數(shù)多于AU治療組，AU治療組多于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。假手術(shù)組僅見少量深棕黃色染色細(xì)胞，腦出血組和AU治療組造模后12 h血腫區(qū)域即出現(xiàn)深棕黃色染色細(xì)胞，并于造模后3 d達(dá)高峰，見表3。

表3 3組大鼠造模后不同時間點血腫周圍腦組織中TNF－α陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s，個)Table 3 Comparison of TNF－α positive cell count in brain tissue around hematoma among 3groups of rats at different time points after modeling

表3 3組大鼠造模后不同時間點血腫周圍腦組織中TNF－α陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s，個)Table 3 Comparison of TNF－α positive cell count in brain tissue around hematoma among 3groups of rats at different time points after modeling

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與腦出血組比較，△P＜0.05

組別只數(shù)66.0±1.26.0±1.27.0±1.16.0±1.25.0±1.1腦出血組626.0±1.2*36.0±1.5*59.0±3.4*32.0±2.9*22.0±2.6* AU治療組619.0±0.6＊△30.0±0.3＊△40.0±3.5＊△25.0±2.2＊△16.0±2.5＊△F 12 h2 d3 d5 d7d假手術(shù)組953.9168.5726.8331.4153.9 P值值0.000.000.000.000.00

3 討論

腦出血后神經(jīng)組織損傷的病理生理機制十分復(fù)雜，具有多因素參與、同步相互作用的特點。實驗表明，血腫周圍的炎性反應(yīng)高峰和細(xì)胞死亡高峰均發(fā)生在自體血注入腦實質(zhì)后48～72 h，表明炎性反應(yīng)與腦出血引起的細(xì)胞損傷有關(guān)，炎性反應(yīng)參與了腦出血后繼發(fā)性腦損傷的病理過程，是腦出血后繼發(fā)性腦損傷不可忽視的因素［6］。而腦組織炎性反應(yīng)過程以小膠質(zhì)細(xì)胞激活和白細(xì)胞浸潤為主，Longa等［6］研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后6 h多形核白細(xì)胞在小血管內(nèi)聚集，2 d后在出血處腦實質(zhì)內(nèi)浸潤。金雷等［7］則報道，腦出血后6～12 h血腫周圍出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤，48～72 h達(dá)到高峰。

腫瘤壞死因子是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，是腦損傷后出現(xiàn)的多向性細(xì)胞因子，其不僅是有效的腫瘤殺傷因子，還是機體炎癥與免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。TNF－α是經(jīng)典的炎性細(xì)胞因子，其參與全身炎性反應(yīng)，與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合可增加過氧化物陰離子、刺激細(xì)胞脫顆粒和分泌髓過氧化物酶，從而使內(nèi)皮細(xì)胞分泌白介素8(IL－8)、白介素(IL－1)和粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM－CSF)等炎性細(xì)胞因子，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上黏附，進(jìn)而刺激機體局部發(fā)生炎性反應(yīng);同時TNF－α通過刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成及釋放IL－1、IL－8而導(dǎo)致炎癥進(jìn)一步發(fā)展。Zhang等［8］研究證明，腦出血大鼠出血側(cè)皮質(zhì)腦組織神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)有TNF－α表達(dá)，48～72 h達(dá)高峰，且與腦含水量呈正相關(guān)。Castillo等［9］研究發(fā)現(xiàn)，腦出血患者發(fā)病后3～4 d血腫周圍水腫程度與發(fā)病后24 h TNF－α水平呈正相關(guān)。本研究采用新鮮未抗凝自體血注入大鼠尾狀核模擬人體腦出血，并在不同時間點進(jìn)行動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，腦出血組和AU治療組血腫周圍腦組織TNF－α表達(dá)增高，3 d達(dá)高峰，呈先增高后降低的趨勢;腦出血組大鼠白細(xì)胞浸潤明顯，3～5 d達(dá)高

峰，血腫周圍腦組織TNF－α陽性細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)目與神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度高峰一致，與以往研究基本一致，進(jìn)一步證實TNF－α能促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)生，加重腦出血后繼發(fā)性腦損傷。因此，抑制炎性細(xì)胞因子、維持體內(nèi)生理平衡將可能成為減輕腦出血后繼發(fā)性腦損傷的新途徑。

AU屬于環(huán)烯醚萜苷類，具有廣泛的藥理作用。Jeong等［4］研究發(fā)現(xiàn)，AU能夠抑制抗原刺激的堿性粒細(xì)胞－2H3肥大細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子κB(NF－κB)的p65亞基由細(xì)胞質(zhì)向核內(nèi)移位，并通過阻止IkBa的磷酸化和降解使胞質(zhì)內(nèi)IkBa水平升高，進(jìn)而抑制NF－κB活性、下調(diào)TNF－α和IL－6的合成與表達(dá)。本研究結(jié)果表明，AU治療組神經(jīng)功能缺損評分及血腫周圍腦組織中TNF－α陽性細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞數(shù)目低于腦出血組，提示AU能抑制TNF－α的合成和表達(dá)，進(jìn)而減少炎性細(xì)胞的趨化、聚集，減輕炎性反應(yīng)及腦出血后繼發(fā)性腦損傷。

綜上所述，降低TNF－α可能是AU減輕腦出血后急性炎性反應(yīng)、阻止腦出血后繼發(fā)性腦損傷、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機制之一，為AU在腦出血急性期的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Neuroprotective Effect of Aucubin and Its Impact on TNF－α in Rats with Cerebral Hemorrhage

LIU Qiu－ting，YAO Jing，TU E－wen，et al．
Department of Neurology，Brain Hospital of Hu'nan，Changsha 410007，China

ObjectiveTo explore the neuroprotective effect of Aucubin and its impact on TNF－α in rats with cerebral hemorrhage.MethodsA total of 90 adult male Sprague－Dawley rats were selected and randomly divided into groups A，B and C，each of 30 cases.Rats of A group were given sham－operation and 0.9%sodium chloride solution injection on tail putamen area，while rats of groups A and B given autologous non－h(huán)eparin anticoagulation arterial blood injection on tail putamen area to establish animal model of cerebral hemorrhage.After 6 hours of surgery，rats of B group were given intraperitoneal injection of Aucubin，while rats of C group were given intraperitoneal injection of 0.9%sodium chloride solution.After 12 hours，2 days，3 days，5 days，7 days of surgery，6 rats were picked out of each group to evaluate the neural function score(by Longa 5－level scoring method)，white blood cells count and cells count with positive TNF－α expression of brain tissues around hematoma(by HE staining and immunohistochemistry method，respectively).ResultsNo statistically significant differences was found of neural function score between groups B and C after 12 hours of surgery(P＞0.05)，while that of B group was significantly lower than that of C group after 2 days，3 days，5 days，7 days of surgery，respectively(P＜0.05).White blood cells count and cells count with positive TNF－α expression of C group were significantly higher than those of B group(P＜0.05)，and those of B group were significantly higher than A group(P＜0.05).ConclusionAucubin has certain neuroprotective effect on cerebral hemorrhage of rats，and its mechanism is likely to correlated with inhibition of TNF－α of brain tissues around hematoma.

Cerebral hemorrhage;Aucubin;Neuron protection;Tumor necrosis factor－alpha;Rats

R 743.347

A

10.3969/j.issn.1008－5971.2015.03.010

2014－10－10;

2015－01－16)

(本文編輯:謝武英)

湖南省科技廳科技項目(2013SK3214)

410007湖南省長沙市，湖南省腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(劉秋庭，涂鄂文，譚莉，李曉輝，王照);湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(姚靚)

姚靚，410007湖南省長沙市，湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院;E－mail:137574248@qq.com