耐熱β-葡聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

孫軍濤,王洪新,呂文平,*

(1.許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南許昌 461000; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

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耐熱β-葡聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

孫軍濤1,2,王洪新2,呂文平2,*

(1.許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南許昌 461000; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

本文利用響應(yīng)面分析對耐熱β-葡聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明:最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成為大麥粉43.48g/L、豆粉34.40g/L、NaCl 2.4g/L、磷酸二氫鉀2.4g/L和磷酸氫二鉀12.5g/L;優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量為(110±2.67)U/mL,比初始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了11%。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和氮源是廉價(jià)的大麥粉和豆粉,大大降低了β-葡聚糖酶的生產(chǎn)成本,具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

耐熱β-葡聚糖酶,培養(yǎng)基優(yōu)化,響應(yīng)面法

在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中,微生物發(fā)酵產(chǎn)酶量一方面取決于菌株本身;另一方面取決于菌株的培養(yǎng)條件,如培養(yǎng)基的組成以及濃度等[1-2],發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)化生產(chǎn)中的必要環(huán)節(jié),具有舉足輕重的作用,篩選得到一個(gè)合適的發(fā)酵培養(yǎng)基,是發(fā)酵產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)中非常重要的一步。本課題組已構(gòu)建了產(chǎn)耐熱、高活性的耐熱β-葡聚糖酶的基因工程菌,在應(yīng)用過程中,還需要對其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,為生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

響應(yīng)面分析方法(Response Surface Methodology,RSM)在培養(yǎng)基優(yōu)化方面的優(yōu)越性已經(jīng)得到證實(shí)[3-5]。不同菌株發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶所用的發(fā)酵培養(yǎng)基不同[6-7],選擇已構(gòu)建的產(chǎn)耐熱高活性的耐熱β-葡聚糖酶的基因工程菌為研究對象,分別對其發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行篩選,利用響應(yīng)面分析方法對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,為耐熱β-葡聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用提供基本參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)和表達(dá)載體pET-30a(+) 購自Invitrogen公司;外源基因?yàn)榻獾矸垩挎邨U菌和熱纖梭菌的融合基因 由本實(shí)驗(yàn)室保存;大麥、麥麩、豆粕、玉米和大豆 購自無錫市場;可溶性淀粉、糊精、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和甘油 購于國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司;硫酸卡那霉素(Kan) 購自鄭州羚銳制藥有限股份公司;種子培養(yǎng)基(g/L) 胰蛋白胨10、酵母膏5和NaCl 10,調(diào)pH至7.0;初始發(fā)酵培養(yǎng)基[8](g/L) 胰蛋白胨12、酵母膏24、甘油6、NaCl 10、KH2PO42.4和K2HPO412.5。

冷凍高速離心機(jī)(5430R,5804R) Eppendorf;UV-2100紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;超聲波細(xì)胞破碎儀 上海寧波科生儀器廠;冷凍氣浴恒溫振蕩器(BS-1E) 金壇市瑞華儀器有限公司;全自動高壓滅菌鍋(SYQ-DSX-280B) 上海申安醫(yī)療器械廠;梅特勒pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司;超凈工作臺(SW-CJ-2D) 蘇潔凈化有限公司;培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

1.2 基因工程菌生長曲線

將活化的種子菌液按照1%(V/V)的接種量接種于裝有50mL含有Kan的LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,在37℃、200r/min轉(zhuǎn)速下的搖床培養(yǎng),分別間隔1h取菌體培養(yǎng)液測定其在600nm處的OD值,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D值為縱坐標(biāo)繪制基因工程菌的生長曲線。

1.3 基因工程菌的培養(yǎng)方法

將活化后的種子菌株按1%(V/V)的接種量接種于裝有50mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,在37℃溫度下,200r/min搖床培養(yǎng)至菌體對數(shù)生長期時(shí),加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6h,發(fā)酵液經(jīng)超聲波破壁后,在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min,上清液即為粗酶液。

1.4 酶活性的測定

酶活性測定采用DNS法[9],酶活力單位定義為:在最適反應(yīng)條件下,單位時(shí)間內(nèi)水解葡聚糖產(chǎn)生1μmol葡萄糖需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.5 培養(yǎng)基的優(yōu)化

分別研究不同碳源、氮源和無機(jī)鹽以及其濃度對基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶活性的影響,并確定三因素三水平的最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析,建立優(yōu)化模型,確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Level and factors of response surface design experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 基因工程菌生長曲線

基因工程菌生長曲線如圖1所示,從生長曲線圖中可以看出:0～4h為延滯期;4～8h為對數(shù)生長期;8～11h為穩(wěn)定期;11h以后為衰亡期。處于對數(shù)生長期的菌,尤其是處于對數(shù)生長期的中、后期的菌的細(xì)胞活力大,適應(yīng)性強(qiáng),有利于菌體細(xì)胞的生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)物的合成。因此選擇該基因工程菌培養(yǎng)生長時(shí)間為5～7h的菌液為種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

圖1 基因工程菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of gene engineering bacteria

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽的選擇

2.2.1.1 碳源 碳源在微生物生長過程中,不僅是構(gòu)成微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要成分,而且為微生物的生長提供能量。在微生物生長過程中需求量較大。在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、可溶淀粉、糊精、麥麩、玉米粉和大麥粉為碳源,代替初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油,研究不同碳源對基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響。結(jié)果見圖2,以大麥粉作為碳源時(shí),基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的量最高,可溶性淀粉次之,以葡萄糖作為碳源時(shí),產(chǎn)β-葡聚糖酶的量最低。以大麥為碳源時(shí)酶活性高,可能是因?yàn)榛蚬こ叹T導(dǎo)后表達(dá)的β-葡聚糖酶將大麥中的β-葡聚糖降解成小分子量的糖,進(jìn)而不斷為菌體的生長繁殖提夠足夠的碳源,保證基因工程菌更好的誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)酶。因此發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇大麥粉作為最佳碳源。

圖2 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the production of β-glucanase

2.2.1.2 氮源 氮源是組成菌體細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的必需營養(yǎng)物質(zhì),一般分為無機(jī)和有機(jī)兩種氮源,其中無機(jī)氮源是菌體生長的速效氮源,而有機(jī)氮源不僅為菌體生長提供氮元素而且還提供必需的生長因子[10]。以大麥粉為碳源,分別用魚粉蛋白胨、胰蛋白胨、豆粉、豆粕、酵母膏、NaNO3、(NH4)2SO4和CO(NH2)2為氮源代替初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和酵母膏,對最佳氮源進(jìn)行篩選,結(jié)果見圖3,利用蛋白胨、豆粉、豆粕和酵母膏有機(jī)氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時(shí),基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的量明顯高于無機(jī)氮源,這可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源不僅能為菌細(xì)胞生長代謝提供氮源,而且還能夠?yàn)榫?xì)胞的生長代謝提供生長因子。其中以豆粉作為氮源時(shí),產(chǎn)β-葡聚糖酶的量最高。因此選擇豆粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖3 不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the production of β-glucanase

2.2.1.3 無機(jī)鹽 無機(jī)鹽是微生物生長繁殖不可缺少的物質(zhì),其主要功能是參與構(gòu)成菌體成分、作為酶的組成部分、維持酶的活性或調(diào)解滲透壓等[11]。分別以大麥粉和豆粉作為碳源和氮源,用CaCl2、MgSO4·7H2O、K2SO4、NaCl、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和MnSO4·5H2O等無機(jī)鹽分別代替初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽NaCl,研究不同無機(jī)鹽對基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響。結(jié)果見圖4,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加CuSO4·5H2O和K2SO4時(shí)的產(chǎn)酶量最低,而添加NaCl和FeSO4·7H2O時(shí)的產(chǎn)酶量最高,選擇NaCl為發(fā)酵培養(yǎng)基的最適無機(jī)鹽。

圖4 無機(jī)鹽對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響Fig.4 Effect of inorganic salts on the production of β-glucanase

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中主要成分的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.2.1 大麥粉濃度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響 用大麥粉和豆粉作為最佳碳源和氮源,代替初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油、酵母膏和蛋白胨,研究不同大麥粉濃度對基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響,結(jié)果見圖5。培養(yǎng)基中大麥粉濃度在5～40g/L之間,隨著大麥粉濃度的增加發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量也隨著增加,當(dāng)大麥粉濃度達(dá)到40g/L時(shí),發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量達(dá)到最高;超過40g/L時(shí),隨大麥粉濃度的提高產(chǎn)酶的量逐步降低,可能是因?yàn)榇篼湻壑泻写罅康钠暇厶?當(dāng)培養(yǎng)基中含有過多的大麥粉時(shí),就會增加了培養(yǎng)基的粘度,降低培養(yǎng)基中的溶氧量,抑制菌體的生長,進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量的降低。

圖5 大麥粉濃度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響Fig.5 Effect of the concentration of barley powder on the production of β-glucanase

2.2.2.2 豆粉濃度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響 選擇濃度為40g/L的大麥粉為碳源,研究不同豆粉濃度對基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響。從圖6可以看出,當(dāng)豆粉濃度達(dá)到30g/L時(shí),基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量最高,發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粉濃度低于30g/L時(shí),因不能為菌體的生長提供足夠的氮源,而影響基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量;豆粉濃度高于30g/L時(shí),導(dǎo)致氮源過剩,容易使培養(yǎng)基中氨的過分積累,使pH的升高,抑制菌體的生長繁殖,最終導(dǎo)致菌體發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量相應(yīng)的降低。

圖6 豆粉濃度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響Fig.6 Effect of the concentration of soybean powder on the production of β-glucanase

2.2.2.3 NaCl濃度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響 分別用濃度為40g/L的大麥粉和30g/L的豆粉作為碳源和氮源,研究不同濃度的NaCl對基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響,結(jié)果見圖7,當(dāng)NaCl濃度為2.0g/L時(shí),基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量最高。低于2.0g/L時(shí),因?yàn)椴荒転榫w的生長提供足夠的無機(jī)鹽,而導(dǎo)致基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量逐漸降低;當(dāng)NaCl的濃度過高時(shí),引起發(fā)酵培養(yǎng)基中具有較高的滲透壓,不利于基因工程菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定,進(jìn)而影響菌體的生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶[12]。

表3 回歸方程的方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation

圖7 NaCl濃度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的影響Fig.7 Effect of the concentration of sodium chloride on the production of β-glucanase

2.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.3.1 回歸方程的建立與分析 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇培養(yǎng)基中的大麥粉、豆粉和NaCl三個(gè)因素作為主要研究對象,進(jìn)行響應(yīng)面分析。用Design Expert 軟件[13],根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以產(chǎn)β-葡聚糖酶的活性為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)15組實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果見表2。根據(jù)測定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式方程的回歸擬合,得到基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的回歸方程:

Y=112.67+4.62A+11.12B+1.25C-4.50AB-2.25AC-3.25BC-4.58A2-8.58B2-5.83C2

其中：A-大麥粉的濃度(g/L),B-豆粉的濃度(g/L),C-NaCl的濃度(g/L),Y-發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的酶活(U/mL)。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

為了檢驗(yàn)回歸方程的可靠性,對擬合的回歸方程進(jìn)行了方差分析(Analysis of Variance,ANOVA),方程分析結(jié)果見表3。該模型顯著(p<0.01),失擬項(xiàng)在a=0.05的水平上不顯著,相關(guān)系數(shù)R2=0.9920,說明該模型的擬合程度較好,可以用此模型來預(yù)測基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的情況。

2.2.3.2 響應(yīng)面交互與優(yōu)化 等高線圖中趨勢線的形狀可以說明兩個(gè)因素間交互作用是否顯著,形狀為圓形的交互作用弱,形狀為橢圓形的交互作用強(qiáng),預(yù)測的最大值通常出現(xiàn)在最小橢圓區(qū)域內(nèi)[14]。從得到的響應(yīng)面圖中可以看出各因素在發(fā)酵產(chǎn)酶過程中的相互作用,確定最佳的發(fā)酵條件。

圖8、圖9和圖10為分析得到的響應(yīng)面圖,各因素以及各因素間交互作用對響應(yīng)值的影響可以直觀地顯示出來。從圖8可以看出,在選定的濃度范圍內(nèi),基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的酶活隨著大麥粉和豆粉濃度的升高而增加,大麥粉和豆粉濃度分別增加到43g/L和34g/L時(shí)酶活性趨于穩(wěn)定;從圖9可以看出,基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的酶活隨著大麥粉和NaCl濃度的增加出現(xiàn)先增大后降低,響應(yīng)較高值落在大麥粉濃度較高而NaCl濃度居中的范圍內(nèi);圖10顯示,基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的酶活性隨豆粉濃度的增加呈現(xiàn)逐步增大的趨勢,而NaCl的濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響不是很明顯。

圖8 大麥粉和豆粉濃度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的響應(yīng)面Fig.8 Response surface plot of effect of barley and soybean powder concentration on production of β-glucanase

圖9 大麥粉和NaCl濃度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的響應(yīng)面Fig.9 Response surface plot of effect of barley powder and sodium chloride concentration on production of β-glucanase

圖10 豆粉和NaCl濃度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的響應(yīng)面Fig.10 Response surface plot of effect of soybean powder and sodium chloride concentration on production of β-glucanase

2.2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design Expert軟件分析,得到發(fā)酵培養(yǎng)基中大麥粉、豆粉和NaCl的最佳條件分別為:大麥粉43.48g/L、豆粉34.40g/L、NaCl 2.4g/L,在此發(fā)酵培養(yǎng)基條件下預(yù)測基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的活性為111.84U/mL。

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性,按照模型優(yōu)化的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件,進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),最終測得發(fā)酵液的平均酶活性為(110±2.67)U/mL,與構(gòu)建的模型預(yù)測值基本一致,證明該模型可以較好地預(yù)測基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的情況。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基比初始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量(99±1.98)U/mL提高了11%。與初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比,優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)β-葡聚糖酶的量雖然沒有得到大幅度的提高,但是優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和氮源分別用的是廉價(jià)的大麥粉和豆粉,大大降低了發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的生產(chǎn)成本,從經(jīng)濟(jì)價(jià)值方面考慮,優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基具有更好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本文選擇已構(gòu)建的耐熱β-葡聚糖酶的基因工程菌為出發(fā)菌株,對其發(fā)酵條件進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化,篩選確定基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為大麥粉、豆粉和NaCl。通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵培養(yǎng)基中大麥粉、豆粉和NaCl的最適用量。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:大麥粉43.48g/L、豆粉34.40g/L、NaCl 2.4g/L、KH2PO42.4g/L和K2HPO412.5g/L。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)β-葡聚糖酶的量為(110±2.67)U/mL,比初始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了11%。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源是大麥粉和豆粉,大大降低了β-葡聚糖酶的生產(chǎn)成本,具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Optimization of culture medium for thermostable β-glucanase

SUN Jun-tao1,2,WANG Hong-xin2,LV Wen-ping2,*

(1.College of Food and Biological Engineering,Xuchang University,Xuchang 461000,China;2. School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In this study,culture medium for thermostable β-glucanase was optimized using response surface methodology. The results indicated that the highest production of β-glucanase could be obtained in the medium containing(g/L):barley powder 43.48,soybean powder 34.40,sodium chloride 2.40,potassium dihydrogen phosphate 2.40 and dipotassium hydrogen phosphate 12.50. Compared with the initial fermentation medium,the product of β-glucanase cultivated by optimized fermentation medium increased by 11%,which was(110±2.67)U/mL. Barley powder and soybean powder were chosen as carbon and nitrogen sources in optimization fermentation medium,which are cheap materials. All of this can significantly reduce the costs of β-glucanase,and has good practical value.

thermostable β-glucanase;culture medium optimization;response surface methodology

2014-06-16

孫軍濤(1982-)，博士，講師，主要從事生物技術(shù)方面的研究工作。

*通訊作者:呂文平(1968-)，男，博士，副教授，研究方向：食品營養(yǎng)與功能因子。

國家自然科學(xué)基金(30972120)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14B416007)；許昌學(xué)院重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目(2014081)；許昌市科技發(fā)展計(jì)劃科技攻關(guān)項(xiàng)目(140202053)。

TS201.3

B

1002-0306(2015)05-0218-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.037