甘草多糖對臍血源單核細胞分化為樹突狀細胞過程中NF-kBp65表達的影響*

唐中生,吳春朋,謝高宇,陸 瑩,羅亞非

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

甘草多糖對臍血源單核細胞分化為樹突狀細胞過程中NF-kBp65表達的影響*

唐中生,吳春朋,謝高宇,陸 瑩,羅亞非

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

目的 觀察臍血源單核細胞分化為樹突狀細胞(DC)的過程中，核轉(zhuǎn)錄因子-kB p65(NF-kB p65)的表達以及GPS對單核細胞分化為DC的影響。方法 無菌條件下采集臍血，非連續(xù)密度梯度離心獲取臍血單核細胞；用含粒單細胞刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)、脂多糖(LPS)和GPS的RPMI-1640培養(yǎng)液分別對細胞因子組、GPS組、聯(lián)合培養(yǎng)組的單核細胞進行體外培養(yǎng)；應(yīng)用倒置相差顯微鏡、瑞氏染色和CD86、CD83、HLA-DR、S-100的免疫細胞化學(xué)法鑒定單核細胞和DC。動態(tài)觀察單核細胞分化為DC過程中不同時間點的NF-kB p65的表達，并進行圖像和SPSS軟件分析。結(jié)果 CD86、CD83、HLA-DR、S-100的免疫細胞化學(xué)法證實所獲單核細胞和DC符合各自的形態(tài)和表型特征。在含GM-CSF和IL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)7d時，單核細胞分化成未成熟DC(imDC)；在含GM-CSF、IL-4和LPS的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)5d時，imDC分化為成熟DC(mDC)，兩者的細胞核內(nèi)NF-kB p65表達具有顯著性差異(P<0.05)。單純用只含GPS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)單核細胞至7d時，可見其細胞核呈NF-kBp65陽性，已分化為imDC，繼續(xù)培養(yǎng)5d，則分化為DC。用含GM-CSF、IL-4和甘草多糖的RPMI-1640培養(yǎng)液聯(lián)合培養(yǎng)7d時，則該單核細胞分化為imDC；加入LPS后繼續(xù)培養(yǎng)5d，imDC的細胞核呈NF-kBp65強陽性，免疫細胞化學(xué)法證實imDC已經(jīng)分化為DC。聯(lián)合培養(yǎng)組細胞的表型表達均強于細胞因子組和GPS組(P<0.05)。結(jié)論 臍血來源單核細胞分化為imDC和mDC過程中，細胞核內(nèi)NF-kB p65表達逐漸增強。單純用GPS(400μg/mL)可以刺激單核細胞分化為imDC和mDC，效果遜于細胞因子GM-CSF、IL-4和LPS共同培養(yǎng)。

樹突狀細胞；細胞表面抗原；核轉(zhuǎn)錄因子-kB p65；甘草多糖；免疫細胞化學(xué)；臍血

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是哺乳動物體內(nèi)功能最強也是唯一能激活幼稚T細胞的專職APC，它能攝取各類抗原，在機體細胞免疫和體液免疫調(diào)控中均起著重要作用。DC基因表達的特殊變化是其成熟過程中的先決條件，但是，目前對于DC特定基因的調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還知之甚少。研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子-KB(NF-kB)作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)著多種基因的表達，并參與免疫反應(yīng)、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)進程。NF-KB系統(tǒng)是由NF-KB家族及其抑制物(inhibition KB，IKB)家族共同組成的復(fù)雜體系，通常N-KB是以最常見的P50/RelA(P65)異源二聚體形式與抑制蛋白IKBs形成三聚體，以非活性形式存在于胞質(zhì)中，只有在受到某些活化因素的刺激時才被激活，從三聚體中解離出來并易位于胞核，與相應(yīng)的靶基因結(jié)合并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。有研究表明，人外周血單核細胞分化為imDC和mDC的過程中，細胞核內(nèi)NF-kB p50表達逐漸增強[1]，而外周血單核細胞分化為imDC和mDC的過程中，細胞核內(nèi)NF-kB p65的表達未見報道。前期研究結(jié)果初步表明[2]，甘草多糖(Glyeyrrhiza Polysaeeharide，GPS)可促進臍血單個核細胞來源DC的分化和成熟，增強DC的免疫學(xué)活性，尤以400μg/mL最佳。本實驗中，我們擬探討在甘草多糖(GPS)的作用下，臍血來源單核細胞分化為DC過程中，細胞核內(nèi)NF-kB p65蛋白的表達變化以及GPS對單核細胞分化過程的影響，進一步探討DC的成熟、分化及其功能之間的關(guān)系。

材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 臍血 新鮮無菌臍血(肝素抗凝)80mL，由學(xué)院一附院產(chǎn)科提供。

1.1.2 藥物 甘草多糖(純度>90%)購自美國泛華醫(yī)藥公司北京代表處。真空干燥的甘草多糖用含雙抗、不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于每次實驗前配制成所需濃度的工作液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾除菌。

1.1.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBCO公司)，淋巴細胞分離液(Ficoll，D=1.077)，上海試劑二廠;胎牛血清(FCS)，(HyClone公司);粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素4(IL-4)、脂多糖(LPS)，均為英國Protechec公司產(chǎn)品;即用型二步法非生物素檢測試劑盒(PV9000)、DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/LpH7.2～7.4)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Forma公司；電控恒溫水浴箱，北京長安科學(xué)儀器廠；LD4-2A型離心機，上海醫(yī)用分析儀器廠；電子天平，德國OHAUS公司；倒置相差顯微鏡，日本NIKON公司；50 cm2，150 cm2塑料培養(yǎng)瓶，美國GIBCO公司產(chǎn)品；病理圖像分析系統(tǒng)，Motic Med CMIAS；全自動酶標儀(550型)BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 單核細胞的獲得 無菌新鮮臍血60 mL，加入1倍體積的RPMI-1640培養(yǎng)液，稀釋，混勻。取50 mL試管，分別加入15 mL淋巴細胞分離液，將30 mL的稀釋血小心鋪于淋巴細胞分離液上，20℃、2000 rpm，離心20 min。小心吸取離心管分層液界面上的白膜層，獲取單個核細胞，移入錐形離心管。重復(fù)2次。用含血清的1640將50 mL離心管中的細胞懸起來，混勻。平均滴加到兩個75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，收集90 min和3 h的貼壁細胞，即為單核細胞。

1.2.2 單核細胞的培養(yǎng)及分組 將獲取的單核細胞調(diào)整濃度為5×106/mL，分為3組，細胞因子組：將5×106/mL的單核細胞置于含有10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)，加入GM-CSF(8×105IU/L)和IL-4(106IU/L)各40 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d后，在RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)加入LPS(50μg/mL)40 μL，繼續(xù)培養(yǎng)5d。GPS組：將5×106/mL的單核細胞置于內(nèi)含等體積10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液配制的GPS液(400 μg/mL)內(nèi)培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 d，第7天時半量換入GPS液。聯(lián)合培養(yǎng)組：將單核細胞加入與細胞因子組相同濃度的培養(yǎng)液內(nèi)，先加入GM-CSF、IL-4各40 μL，后加入GPS液(400 μg/mL)，第7天時加入LPS(50 μg/mL)40 μL，繼續(xù)培養(yǎng)5 d。

1.3 細胞離心涂片 以上各組均在第7d、第12d用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重新懸浮細胞，計數(shù)并進行細胞離心涂片，進行瑞氏染色和免疫細胞化學(xué)染色。

1.4 倒置相差顯微鏡觀察 倒置相差顯微鏡下觀察不同分組，處于細胞培養(yǎng)液中正常生活狀態(tài)下的單核細胞、imDC以及mDC的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點。

5瑞氏染色 瑞氏染液滴染5min后，加入等量的蒸餾水，洗耳球吹打混勻，繼續(xù)染5min。蒸餾水沖洗，吹干，95%酒精涮洗1-3秒，晾干，入二甲苯中脫蠟，封片觀察。

1.6 免疫細胞化學(xué) 按試劑盒說明書進行。陰性對照采用PBS代替一抗。

1.7 圖像和統(tǒng)計學(xué)分析 利用病理分析系統(tǒng)對各培養(yǎng)組的細胞在7d、12d進行細胞核內(nèi)NF-kB p65平均吸光度(AA)測定，并采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件對其進行分析，顯著性差異的界值為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察 倒置相差顯微鏡下觀察純化獲得的人臍血單核細胞，可見細胞呈散在貼壁生長，細胞體呈圓形，表面光滑；細胞核呈圓形，多位于中央。倒置相差顯微鏡下觀察加入GM-CSF、IL-4的細胞因子組體外培養(yǎng)7d的單核細胞，可見細胞呈貼壁生長，細胞體積增大，大小不等，形態(tài)不規(guī)則。加入GM-CSF、IL-4和LPS繼續(xù)培養(yǎng)5d，細胞多呈懸浮生長，體積較大，大小不等，細長的突起較多，有的細胞貼壁生長，呈桿狀、梭狀、多角形等多種形態(tài)；細胞核大而不規(guī)則，細胞質(zhì)內(nèi)可見空泡和顆粒狀物?？梢娖湟逊只癁槲闯墒鞓覦C，呈現(xiàn)毛刺樣突起，粗細不等。甘草多糖組的單核細胞培養(yǎng)7d后，細胞體積增大，大小不等，形態(tài)不規(guī)則(圓形、橢圓形或長梭形)，表面呈現(xiàn)出毛刺樣突起，粗細不等，有的突起末端鈍圓，有的細長，可在培養(yǎng)液中擺動和收縮；細胞核呈圓形，位于中央，大而不規(guī)則；(見圖1)培養(yǎng)12d時，細胞形態(tài)呈不規(guī)則形，出現(xiàn)密集的毛刺樣突起，呈現(xiàn)典型的DC形態(tài)。(見圖2)聯(lián)合細胞組：可見培養(yǎng)7d的細胞數(shù)量明顯增多，細胞形態(tài)不規(guī)則，并出現(xiàn)長短不一、毛刺樣和樹枝樣的細胞突起；繼續(xù)培養(yǎng)至12d，細胞形態(tài)呈不規(guī)則形，毛刺樣突起密集，已經(jīng)分化為成熟DC。

圖1 甘草多糖組，體外培養(yǎng)7d，人imDC倒置顯微鏡觀察，可見細胞表面呈現(xiàn)出毛刺樣突起，粗細不等。

圖2 甘草多糖組，體外培養(yǎng)12d，人mDC倒置顯微鏡觀察，可見細胞形態(tài)呈不規(guī)則形，出現(xiàn)密集的毛刺樣突起。

圖3 甘草多糖組，體外培養(yǎng)7d，人imDC瑞氏染色，光鏡觀察，細胞數(shù)量多，呈圓形，細胞核呈腎形或馬蹄形，現(xiàn)細胞突起。

圖4 甘草多糖組，體外培養(yǎng)12d，人mDC瑞氏染色，光鏡觀察，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞突起明顯。

2.2 瑞氏染色 純化獲得的臍血單核細胞體積較大，大多呈圓形 ，未見細胞突起；細胞核呈現(xiàn)腎形或馬蹄形，細胞質(zhì)弱嗜堿性，染為灰藍色。細胞因子組培養(yǎng)7 d的imDC，體積增大，形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)長短不一的突起；細胞核多為圓形，有凹陷；細胞質(zhì)染成藍紫色，內(nèi)含有較多的脂滴；培養(yǎng)至第12 d，imDC分化為mDC,其細胞體積繼續(xù)增大，細胞突起增多；細胞核偏位；細胞質(zhì)內(nèi)有空泡。GPS組培養(yǎng)7 d的imDC，體積增大，形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)長短不一的突起；細胞核多為圓形，偏位，有凹陷；細胞質(zhì)染成藍紫色，內(nèi)含有較多脂滴(見圖3)；培養(yǎng)至第12 d，imDC分化為mDC,其細胞體積繼續(xù)增大，細胞突起增多；細胞核偏位；細胞質(zhì)內(nèi)有空泡(見圖4)。聯(lián)合培養(yǎng)組體外培養(yǎng)第7d時，imDC的體積比細胞因子組同時期增大，細胞數(shù)目也增多；細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞突起較多，有的呈面紗樣突起；細胞核體積也增大；細胞質(zhì)染成藍紫色，不含脂滴。體外培養(yǎng)第12 d時，mDC的體積更加增大，形態(tài)極不規(guī)則，呈橢圓形、多邊形，細胞表面有大量毛刺樣突起；細胞質(zhì)內(nèi)未見空泡。

2.3 免疫細胞化學(xué)結(jié)果 純化獲得的臍血單核細胞表達表面分化抗原CD86。細胞因子組培養(yǎng)7d后，imDC的細胞核呈NF-kB p65弱陽性，但細胞質(zhì)呈較強陽性反應(yīng)，顯棕黃色；imDC的細胞質(zhì)呈HLA-DR陽性表達。加入TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)5d，imDC分化為mDC，其細胞核呈NF-kB p65強陽性反應(yīng)，著色深，細胞質(zhì)呈弱陽性；mDC的細胞質(zhì)呈HLA-DR陽性反應(yīng)增強，細胞膜上也出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細胞核呈陰性。GPS組：體外培養(yǎng)7d后，單核細胞的細胞核也呈NF-kB p65弱陽性，染為棕黃色，免疫細胞化學(xué)鑒定結(jié)果顯示其也分化為imDC。繼續(xù)換液培養(yǎng)5d，imDC分化為mDC，其細胞核呈NF-kB p65強陽性反應(yīng)，著色深，細胞質(zhì)呈弱陽性；聯(lián)合培養(yǎng)組：體外培養(yǎng)7d，單核細胞即分化為imDC，其細胞核呈NF-kB p65弱陽性，染色淺；加入TNF-α后繼續(xù)培養(yǎng)5d，imDC即分化為mDC，可見其細胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯的NF-kB p65強陽性反應(yīng)，與細胞因子組相比較，染色深；且mDC的HLA-DR表達也增強。

2.4 圖像及統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果 細胞因子組、GPS組、聯(lián)合培養(yǎng)組3組中，GPS組可使單核細胞分化為imDC和mDC，而且第7 d和第12 d的NF-kB p65表達存在差異。3組組內(nèi)比較，NF-kB p65表達隨著DC的不斷分化成熟而有所增加(P<0.05)；組間比較，可見聯(lián)合培養(yǎng)組第12d mDC的NF-kB p65表達強于細胞因子組和GPS組(P<0.05)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 各實驗組不同時間點細胞核內(nèi)NF-kB p65平均吸光度值(AA)

細胞因子組：體外培養(yǎng)7d的imDC與12d的mDC細胞核內(nèi)NF-kB p65表達比較，兩者具有顯著性差異，P<0.05；GPS組：體外培養(yǎng)7d的imDC與12d的mDC細胞核內(nèi)NF-kB p65表達比較，兩者具有顯著性差異，P<0.05；聯(lián)合培養(yǎng)組：體外培養(yǎng)7d的imDC與12d的mDC核內(nèi)NF-kB p65表達比較，兩者具有顯著性差異，P<0.05；聯(lián)合培養(yǎng)組、GPS組：體外培養(yǎng)12d的mDC核內(nèi)NF-kB p65表達，兩者比較具有顯著性差異，P<0.05。

3 討論

研究結(jié)果表明[3]，核轉(zhuǎn)錄因子-kB(nuclear factor-kappa B,NF-kB)是從成熟B細胞中提取的，并能與免疫球蛋白K鏈基因增強子相結(jié)合的核因子。在哺乳動物中，NF-kB家族有p50/p105(NF-kB1)、p65(Re1A)、C-re1、p52/p-100(NF-kB2)和Re1B 5個成員。NF-kB p65作為NF-kB家族中的重要成員，在細胞生長調(diào)控中發(fā)揮著重要影響。DC是機體內(nèi)重要的抗原呈遞細胞，在其生長過程中，細胞的形態(tài)和免疫功能發(fā)生著重要的變化，在從抗原捕獲到抗原呈遞過程中，其表面分子抗原發(fā)生著很大的變化，這是因為相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達。筆者探討了NF-kB p65對DC生長和分化中的作用，以及加入GPS后對NF-kB p65和其它表面分子抗原在DC表達的影響。

單核細胞在含GM-CSF、IL-4的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)7d，再加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)5d，則分化為imDC和mDC。在分化過程中，其細胞核內(nèi)的NF-kB p65含量不斷增加，同時細胞表面分化抗原也發(fā)生了變化，如CD86、HLA-DR和S-100的表達均增加，結(jié)果提示，NF-kB p65在其分化成熟過程中發(fā)揮著重要的作用，并且由此可以根據(jù)蛋白變化的這個特點來推斷DC在體內(nèi)處于成熟分化的哪個階段，同時也可以作為一種有用的表面標志。在單核細胞培養(yǎng)過程中，加入400μg/mL GPS后，培養(yǎng)至7d時，其細胞核內(nèi)的NF-kB p65表達增加，且單核細胞轉(zhuǎn)化為imDC，培養(yǎng)至12d時，轉(zhuǎn)化為mDC。聯(lián)合培養(yǎng)組的單核細胞在培養(yǎng)7d時，已分化為imDC，與GPS組比較，細胞狀態(tài)更為良好，數(shù)目增多；若加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)5d時，細胞在形態(tài)學(xué)上完整，細胞突起增多，且細胞核內(nèi)NF-kB p65表達增加。

作為專職的抗原呈遞細胞，國、內(nèi)外已經(jīng)逐漸重視DC疫苗在抗腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用，成為當今腫瘤免疫治療的熱點[4-6]。如何提高其呈遞抗原的效率以及提高其對腫瘤的殺傷率有著很重要的意義。本實驗觀察了NF-kB p65在DC成熟過程中的變化，再結(jié)合NF-kB家族中其它成員的表達變化可以作為判斷體內(nèi)DC處于何種發(fā)育分化階段，從而可以加入其它一些因素來促進DC的成熟，增強人體的免疫力和DC抗腫瘤的能力。

甘草為常用中藥，性味甘平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具益氣補中，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和藥性之功效。甘草的有效成分主要是甘草甜素、甘草次酸、甘草苷元和甘草多糖。甘草多糖(GPS)主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖組成。藥理研究發(fā)現(xiàn)[7]，GPS具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗腫瘤、抗病毒、防治骨關(guān)節(jié)炎、抗氧化等作用，而且無細胞毒作用。GPS能明顯提高小鼠的生長性能和T細胞的E玫瑰花環(huán)數(shù)量[8]，能誘導(dǎo)激活淋巴細胞，提高其能量代謝水平和IL-2的分泌，具有免疫調(diào)節(jié)作用[9]，對小鼠機體免疫有增強作用[10]。GPS也可能通過降低荷瘤小鼠Treg細胞的比例及提高脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率而發(fā)揮抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用[11]，GPS可有效抑制大鼠肝腫瘤的生長[12]。孫氏等研究表明：GPS能夠促進人外周血γδT細胞增殖、分泌細胞因子及殺傷腫瘤細胞[13]。但GPS對DC的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未見報道。在本實驗中，GPS對DC的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，細胞的生長、分化以及功能有著一定的影響。GPS可以替代細胞因子的作用使單核細胞分化成為DC，且細胞形態(tài)更為明顯，細胞突起增多，細胞表面分子抗原表達增多，但遜于細胞因子與甘草多糖聯(lián)合培養(yǎng)。實驗結(jié)果表明，GPS可以替代各種因子發(fā)揮促進臍血來源單核細胞分化為DC的作用。

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貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(NO：QZYY2010-04)，貴州省科技廳和貴陽中醫(yī)學(xué)院聯(lián)合基金課題(NO：黔科合中藥字〔2011〕LKZ7036號)，貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目(NO：黔科合J字〔2012〕2078號)。

唐中生(1977.08-)，男，貴州遵義人，碩士，副教授，主要從事樹突狀細胞生物學(xué)的研究。Tel：13885085968，E-mail：tzs351213@126.com。

R285.5

A

1007-2349(2015)10-0060-04

2015-07-05)