雙峰駝天然重鏈抗體可變區(qū)酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定

胡湘云，高小龍，付向晶，劉丹丹，范文濤，王燕平，杜恩岐，王興龍，黨如意，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

雙峰駝天然重鏈抗體可變區(qū)酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定

胡湘云，高小龍，付向晶，劉丹丹，范文濤，王燕平，杜恩岐，王興龍，黨如意，楊增岐*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

構(gòu)建雙峰駝天然重鏈抗體可變區(qū)(VHH)酵母雙雜交文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行鑒定。采集未經(jīng)免疫的6月齡雌性雙峰駝外周血、骨髓、脾和淋巴結(jié)，并從外周血中分離淋巴細(xì)胞。抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用2對(duì)引物經(jīng)過(guò)2輪PCR擴(kuò)增得到400 bp左右的雙峰駝VHH片段。根據(jù)Clontech公司Mate & PlateTMlibrary construction system使用手冊(cè)，將帶有同源臂的VHH片段與線性化的pGADT7-Rec質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布SD/-Leu平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d后，收集平板上的所有克隆，即為雙峰駝天然重鏈抗體可變區(qū)酵母雙雜交文庫(kù)。對(duì)文庫(kù)的滴度、重組效率及多樣性進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，本研究構(gòu)建的雙峰駝天然重鏈抗體可變區(qū)酵母雙雜交文庫(kù)庫(kù)容為2.07×107，滴度為7.6×108cfu·mL-1。隨機(jī)挑取47個(gè)獨(dú)立克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，43個(gè)含有VHH片段，重組率為91.5%；選取其中19個(gè)測(cè)序，均為獨(dú)立克隆，且多樣性好。該研究成功構(gòu)建雙峰駝天然重鏈抗體可變區(qū)酵母雙雜交文庫(kù)，且文庫(kù)質(zhì)量滿足要求，為進(jìn)一步獲得特定抗原的VHH奠定了基礎(chǔ)。

雙峰駝；重鏈抗體可變區(qū)；酵母雙雜交

重鏈抗體可變區(qū)(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)是目前研究熱度最高的基因工程抗體之一[1-2]，其衍生于駱駝科動(dòng)物和鯊魚(yú)體內(nèi)天然存在的重鏈抗體，是目前發(fā)現(xiàn)天然存在的具有抗原結(jié)合功能的最小抗體片段，相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H為15 ku，為傳統(tǒng)抗體的1/10[3-4]。由于VHH呈橢球形，高度僅為4.8 nm，直徑僅為2.2 nm，因此又被稱(chēng)為納米抗體(nanobodies，Nbs)。相對(duì)傳統(tǒng)的單克隆抗體而言，VHH具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如相對(duì)分子質(zhì)量小，容易制造和表達(dá)，高水溶性且穩(wěn)定性強(qiáng)，能識(shí)別隱蔽表位和酶的裂隙，可以表達(dá)成胞內(nèi)抗體，具有較高的親和力及低免疫原性等[5-6]。上述特點(diǎn)使VHH在醫(yī)學(xué)診斷和治療以及蛋白質(zhì)組學(xué)方面受到越來(lái)越高的重視[7-8]。

目前VHH的制備技術(shù)包括噬菌體展示技術(shù)、酵母展示技術(shù)和核糖體展示技術(shù)等，其中噬菌體展示技術(shù)最為常用[9-10]。噬菌體展示技術(shù)所構(gòu)建的抗體庫(kù)可分為免疫文庫(kù)和非免疫文庫(kù)，非免疫文庫(kù)由于未經(jīng)抗原刺激，所以抗體多樣性強(qiáng)于免疫庫(kù)，一旦構(gòu)建完成，可用多種抗原進(jìn)行篩選，避免了免疫動(dòng)物這一繁瑣的環(huán)節(jié)，縮短了抗體制備時(shí)間，在新疫病快速診斷治療中更具優(yōu)勢(shì)[8，11]。雖然噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)應(yīng)用廣泛，但其存在一定的缺陷，例如：噬菌體展示抗體庫(kù)使用原核表達(dá)系統(tǒng)將抗體展示在噬菌體表面，缺乏翻譯后修飾能力，可能會(huì)引起抗體活性降低，導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)；同時(shí)其篩選過(guò)程是在體外進(jìn)行的，不適合研究抗原抗體在細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)活性。

利用酵母雙雜交抗體庫(kù)則可實(shí)現(xiàn)抗原抗體在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與篩選，彌補(bǔ)了噬菌體展示抗體庫(kù)原核表達(dá)展示導(dǎo)致抗體活性降低這一缺陷，能更好地反映抗原抗體在體內(nèi)反應(yīng)的情況，并且避免了噬菌體抗體庫(kù)篩選前期抗原制備環(huán)節(jié)。因此，相對(duì)噬菌體展示抗體庫(kù)而言，酵母雙雜交抗體庫(kù)具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[12]。X.Fu等學(xué)者構(gòu)建了PCV2 VHH酵母雙雜交文庫(kù)，并成功篩選出了Cap蛋白的VHH[13]。但目前尚未見(jiàn)有關(guān)雙峰駝天然VHH酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建的報(bào)道。為此，本研究擬構(gòu)建雙峰駝天然重鏈抗體可變區(qū)酵母雙雜交文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為后續(xù)篩選多種抗原的VHH奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Ficoll Paque PLUS購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech；總RNA提取試劑盒(RNeasy?Plus Mini Kit)和膠回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；2K plus DNA marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DL2000 DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司；SD/-Leu選擇性培養(yǎng)基、YPDA培養(yǎng)基、50% PEG 3350、10×TE、10×LiAc、Yeastmaker Carrier DNA和3 mol·L-1醋酸鈉溶液等試劑均購(gòu)自Clontech公司；DMSO、甘油購(gòu)自Sigma公司；瓊脂糖購(gòu)自Invitrogen公司；無(wú)水乙醇等其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌株及載體

Y187酵母菌和pGADT7-Rec線性化載體購(gòu)自Clontech公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡雌性雙峰駝，購(gòu)于甘肅金昌。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上收錄的VHH的核苷酸序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物用于擴(kuò)增VHH片段。CALL01和CALL02為第一對(duì)引物，用以擴(kuò)增大小分別為900 bp的VH-CH1-CH2片段和600 bp的VHH-CH2。VHH-up和VHH-down為第二對(duì)引物，用以從600 bp的VHH-CH2中擴(kuò)增得到大小約為400 bp的VHH片段。T7和3′AD為pGADT7-Rec載體上的通用引物，用于文庫(kù)質(zhì)量的PCR鑒定(表1)。引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 文庫(kù)構(gòu)建及鑒定所用引物

Table 1 Primers used for library construction and characterization

引物Primer核苷酸序列(5'-3')Primersequence(5'-3')CALL01GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGCALL02GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCCVHH-upTTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGGAGTCTGGRGGAGGVHH-downGTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCWGGGTT7TAATACGACTCACTATAGGG3'ADAGATGGTGCACGATGCACAG

斜體部分為同源臂

Letters in italics is the homologous arms

1.5 樣品采集、淋巴細(xì)胞分離、總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

雙峰駝安樂(lè)死后，無(wú)菌采集脾、淋巴結(jié)和骨髓，立即置液氮保存?zhèn)溆?，之后用液氮進(jìn)行研磨。頸靜脈采血，收集抗凝血與等體積磷酸緩沖液PBS(pH 7.4)混合，加入Ficoll Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離。參照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提淋巴細(xì)胞、脾、淋巴結(jié)和骨髓的總RNA，置于-80 ℃保存。以總RNA為模板，Oligo(dT)為引物，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行第一條鏈cDNA的合成，置于-20 ℃保存。

1.6VHH片段的擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用引物CALL01和CALL02在TaqDNA聚合酶的作用下，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，預(yù)期會(huì)出現(xiàn)大小為900和600 bp兩條帶。

切膠回收600 bp左右目的條帶，以此為模板，用引物VHH-Up和VHH-Down在TaqDNA聚合酶作用下進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增獲取VHH片段，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶，預(yù)期條帶大小400 bp。用膠回收試劑盒回收400 bp的VHH片段，并測(cè)定其濃度。

1.7VHH片段的濃縮

向回收的400 bpVHH片段中加入1/10體積3 mol·L-1醋酸鈉和2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，用乙醇沉淀法對(duì)其進(jìn)行濃縮。最后溶于20 μL滅菌水中，并測(cè)定濃度，使得濃縮后質(zhì)量濃度達(dá)到2～5 μg·20 μL-1。

1.8 Y187感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

根據(jù)Clontech公司Yeastmaker Yeast Transformation System 2的操作說(shuō)明，進(jìn)行Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備。依照Mate & PlateTMLibrary System使用手冊(cè)的操作說(shuō)明和參考文獻(xiàn)[13]，進(jìn)行VHH片段和pGADT7-Rec轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞。取轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物涂布80～100個(gè)150 mm SD/-Leu選擇性營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。

1.9 文庫(kù)菌的收獲

待平板上長(zhǎng)出菌落后，置于4 ℃固化3～5 h；加入YPDA液體培養(yǎng)基(含25%甘油)，用已滅菌的涂菌棒刮取平板上的所有菌落，充分混勻后，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 雙峰駝VHH抗體庫(kù)的庫(kù)容量、滴度和多樣性鑒定

按照Mate & PlateTMLibrary System User Manual的操作說(shuō)明采用梯度稀釋法，分別將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和文庫(kù)菌做倍比稀釋?zhuān)坎糞D/-Leu選擇性營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，計(jì)數(shù)各稀釋梯度平板上的菌落數(shù)，計(jì)算抗體庫(kù)的庫(kù)容和滴度。

隨機(jī)挑選SD/-Leu平板上長(zhǎng)出的克隆以3′AD和T7為引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析文庫(kù)的重組率。隨機(jī)挑取菌落PCR呈陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，分析文庫(kù)的多樣性。

2 結(jié) 果

2.1 淋巴細(xì)胞的分離及RNA提取

用淋巴細(xì)胞分離液從100 mL的外周血中最終分離到108個(gè)單核細(xì)胞。用RNA試劑盒抽提的RNA質(zhì)量濃度為600 ng·μL-1，A260 nm/A280 nm值為2.01，滿足建庫(kù)需要。

2.2 VHH片段的擴(kuò)增

使用2 μL總RNA(20 μL體系)作為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA的合成。以制備的cDNA為模板，用CALL01和CALL02為引物進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，出現(xiàn)兩條特異性條帶，大小分別為900和600 bp。

M.2K plus DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.引物CALL01和CALL02擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；6.陰性對(duì)照M.2K plus DNA marker；1-5.PCR products of primer CALL01 and CALL02；6.Negative control圖1 第一輪PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of first round PCR products

回收第一輪PCR產(chǎn)物中600 bp的片段，以此為模板，用引物VHH-up和VHH-down進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，出現(xiàn)一條與預(yù)期一致的400 bp的目的條帶，即為VHH片段。

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-6.VHH PCR產(chǎn)物；7.陰性對(duì)照M.DNA marker DL2000；1-6.PCR products of VHH；7.Negative control圖2 第二輪PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of second round PCR products

2.3VHH片段的濃度

400 bpVHH片段經(jīng)膠回收和濃縮后，測(cè)得VHH片段質(zhì)量濃度為220 ng·μL-1，滿足20 μL中含2～5 μg的建庫(kù)要求。

2.4 文庫(kù)的庫(kù)容量和多樣性鑒定

將濃縮的20 μL VHH片段和3 μg pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋后涂100 μL于SD/-Leu平板上，經(jīng)計(jì)算文庫(kù)庫(kù)容量達(dá)2.07×107，滿足酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建要求。文庫(kù)菌進(jìn)行梯度稀釋后涂布SD/-Leu平板，經(jīng)計(jì)算文庫(kù)滴度為7.6×108cfu·mL-1。

從SD/-Leu平板上隨機(jī)挑取的47個(gè)克隆，用通用引物T7和3′AD進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖3。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示隨機(jī)的47個(gè)克隆中有43個(gè)均為陽(yáng)性克隆，抗體庫(kù)的重組率達(dá)91.5%，顯示文庫(kù)的插入率良好。

M.2K plus DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～47.隨機(jī)挑選的菌落；48.陰性對(duì)照M.2K plus DNA marker；1-47.Randomly picked colonies；48.Negative control圖3 文庫(kù)菌落PCR鑒定Fig.3 Colony PCR identification results

隨機(jī)挑選19個(gè)菌落PCR呈陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI發(fā)表的VHH進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示這些序列與駱駝屬的重鏈抗體重鏈可變區(qū)高度同源，均為VHH。用Clone Manager軟件對(duì)19個(gè)序列進(jìn)行相互比對(duì)，結(jié)果如圖4，顯示此19個(gè)VHH序列均為獨(dú)立克隆，且在FR1區(qū)22位、FR3區(qū)102位特定位置均含有半胱氨酸，F(xiàn)R2區(qū)37、44、45、47位的氨基酸堿基由疏水性堿基變?yōu)橛H水性堿基，符合納米抗體的結(jié)構(gòu)特征，表明抗體庫(kù)多樣性較好。19個(gè)序列的GenBank登錄號(hào)為RF179360～179383。

“.”表明與第一行序列相同的序列，不同的序列由陰影區(qū)表示，“-”表明缺失的序列，F(xiàn)R1、FR3區(qū)實(shí)線圖框內(nèi)為半胱氨酸殘基，F(xiàn)R2區(qū)虛線圖框內(nèi)為納米抗體4個(gè)保守的特有的親水性堿基The dots denote the same sequences compared with VHH1，differences in the sequence are shadowed，and the dash shows the missing sequences.The hallmark Cys residues in FR1 and FR3 are denoted by the thick-line boxes.The four conservative hallmark residues of VHH in FR2 are denoted by the dotted line boxes.圖4 19個(gè)VHH片段的氨基酸序列分析Fig.4 Amino acids sequence alignment of 19 VHH antibody fragments

3 討 論

針對(duì)目前在疾病治療和蛋白質(zhì)功能研究上面臨的缺少能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的抗體的這一難題，作者以VHH作為突破口。相對(duì)于常規(guī)的單鏈抗體(single chain of variable fragment，scFv)而言，VHH作為一種基于重鏈抗體的新型抗體，可在真核細(xì)胞內(nèi)更好地正確折疊，且可溶性強(qiáng)、表達(dá)量大[14]。當(dāng)前VHH的主流篩選技術(shù)為噬菌體展示技術(shù)，如前文所述，其存在難以規(guī)避的缺陷，而酵母雙雜交技術(shù)則彌補(bǔ)了這一缺陷。鑒于此點(diǎn)，作者選用酵母雙雜交技術(shù)構(gòu)建VHH文庫(kù)以進(jìn)行抗體篩選。

文庫(kù)構(gòu)建中為了避免VH基因的干擾，作者采取2輪PCR獲得VHH[15]。第一輪PCR以CALL01和CALL02為引物成功擴(kuò)增出約900 bp的VH-CH1-CH2和600 bp的VHH-CH2。第二輪PCR以回收的600 bpVHH-CH2為模板，用引物VHH-up和VHH-down成功擴(kuò)增VHHFR1到FR4之間的區(qū)段，并通過(guò)引物上所帶同源臂克隆至pGADT7-Rec載體上，隨機(jī)挑取的19個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果顯示均符合VHH特征。

文庫(kù)庫(kù)容和多樣性是文庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。本研究采用Clontech公司酵母雙雜交技術(shù)，通過(guò)線性化載體與目的基因末端同源序列，利用同源重組將VHHs序列克隆到載體中，避免了傳統(tǒng)酶切和連接這一步驟，簡(jiǎn)化了操作流程；用PEG/LiAC法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)4.14×106cfu·3 μg-1。從轉(zhuǎn)化后的平板隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示納米抗體酵母文庫(kù)的插入重組率可達(dá)91.5%。高的轉(zhuǎn)化效率和重組率保證了最終的文庫(kù)庫(kù)容為2.07×107。隨機(jī)挑取19個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示均為獨(dú)立克隆，在FR1區(qū)第22位和FR3區(qū)第102位堿基均含半胱氨酸殘基，并且在FR2區(qū)上4個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基滿足Val37Phe/Tyr、Gly44Glu、Leu 45Arg/Cys/His、Trp47Gly/Leu/Glu的特征，與之前關(guān)于VHH特征序列的報(bào)道相符[16]；表明文庫(kù)多樣性良好。同時(shí)FR1區(qū)和FR3區(qū)的半胱氨酸可穩(wěn)定長(zhǎng)的CDR3區(qū)形成的大凸環(huán)結(jié)構(gòu)，以便能很好的識(shí)別空間構(gòu)象上的裂隙和空腔結(jié)構(gòu)，37、44、45、47位存在特征性的氨基酸殘基替換使得VHH溶解性增強(qiáng)[16]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了雙峰駝天然重鏈抗體可變區(qū)酵母雙雜交文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)滴度、重組率及序列多樣性進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步篩選特定抗原的VHH奠定基礎(chǔ)。

[1] VANLANDSCHOOT P，STORTELERS C，BEIRNAERT E，et al.Nanobodies?：new ammunition to battle viruses [J].AntiviralRes，2011，92(3)：389-407.

[2] MONEGAL A，AMI D，MARTINELLI C，et al.Immunological applications of single-domain Ilama recombinant antibodies isolated from a na?ve library [J].ProteinEngDesSel，2009，22(4)：273-280.

[3] HAMERS-CASTERMAN C，ATARHOUCH T，MUYLDERMANS S，et al.Naturally occurring antibodies devoid of light chains [J].Nature，1993，363(6428)：446-448.

[4] GREENBERG A S，AVILA D，HUGHES M，et al.A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks [J].Nature，1996，374(6518)：168-173.

[5] HARMSEN M M，DE HAARD H J.Properties，production,and applications of camelid single-domain antibody fragments [J].ApplMicrobiolBiotechnol，2007，77(1)：13-22.

[6] DUMOULIN M，CONRATH K，VAN MEIRHAEGHE A，et al.Single-domain antibody fragments with high conformational stability [J].ProteinSci，2002，11(3)：500-515.

[7] MUYLDERMANS S，BARAL T N，RETAMOZZO V C，et al.Camelid immunoglobulins and nanobody technology [J].VetImmunolImmunopathol，2009，128(1-3)：178-183.

[8] RAHBARIZADEH F，AHMADVAND D，SHARIFZADEH Z.Nanobody：an old concept and new vehicle for immunotargeting [J].ImmunolInvest，2011，40(3)：299-338.

[9] SABIR J S，ATEF A，EI-DOMYATI F M，et al.Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library [J].CRBiol，2014，337(4)：244-249.

[10] RYCKAERT S，PARDON E，STEYAERT J，et al.Isolation of antigen-binding camelid heavy chain antibody fragments (nanobodies) from an immune library displayed on the surface of Pichia pastoris [J].JBiotechnol，2010，145(2)：93-98.

[11] SILACCI M，BRACK S，SCHIRRU G，et al.Design，construction，and characterization of a large synthetic human antibody phage display library [J].Proteomics，2005，5(9)：2340-2350.

[12] YANG M，WU Z，F(xiàn)IELDS S.Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system [J].NucleicAcidsRes，1995，23(7)：1152-1156.

[13] FU X，GAO X，HE S，et al.Design and selection of a camelid single-chain antibody yeast two-hybrid library produced de novo for the cap protein of porcine circovirus type 2 (PCV2) [J].PLoSOne，2013，8(3)：e56222.

[14] ARBABI GHAHROUDI M，DESMYTER A，WYNS L，et al.Selection and identification of single domain antibody fragment from camel heavy-chain antibodies [J].FEBSLett，1997，414(3)：521-526.

[16] VU K B，GHAHROUDI M A，WYNS L，et al.Comparison of Ilama VH sequences from conventional and heavy chain antibodies [J].MolImmunol，1997，34(16-17)：1121-1131.

(編輯 白永平)

Construction and Characterization of a NaiveCamelusBactrianusVariable Domain of Heavy Chain of Heavy-Chain Antibody(VHH)Yeast Two-Hybrid Library

HU Xiang-yun ，GAO Xiao-long，F(xiàn)U Xiang-jing，LIU Dan-dan，F(xiàn)AN Wen-tao，WANG Yan-ping，DU En-qi，WANG Xing-long，DANG Ru-yi，YANG Zeng-qi*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

The aim of this study was to construct and characterize of a naiveCamelusbactrianusvariable domain of heavy chain of heavy-chain antibody(VHH)yeast two-hybrid library.The blood，bone marrow，spleen and lymph node were collected from a healthy non-immunized 6 month-old femaleCamelusBactrianus. And peripheral lymphocytes were isolated from blood samples using Ficoll Paque PLUS reagent.Then total RNA was extracted from peripheral lymphocytes，bone marrow，spleen and Lymph nodes.Reverse-transcription was performed to generate the first-stand cDNA.VHH fragments were amplified through two rounds PCR using two pairs of specific primers.NaiveCamelusBactrianusVHH yeast two-hybrid library was successfully constructed according to Clontech Mate & Plate library construction system user manual.Briefly，5 μg VHHs fragment containing homologous arms in 20 μL were co-transformed with 6 μL linearized pGADT7-Rec plasmid into component Y187 yeast cells，and transformation products were plated on SD/-Leu plates.After 3-5 days incubation at 30 °C，the library was harvested and the library quality were evaluated by titer，recombination efficiency，diversity and complexity.The results showed that there were 2.07×107independent clones in the naive VHH yeast two-hybrid library and the library titer was 7.6×108cfu·mL-1.PCR results showed that 43 independent clones inserted VHHs fragment in 47 randomly picked out clones，and the recombination efficiency was 91.5%.Nineteen independent clones were random picked out to sequence and sequence results indicate they all share unique sequences.In a conclusion，a naiveCamelusBactrianusvariable domain of heavy chain of heavy-chain antibody yeast two-hybrid library was successfully constructed with large capacity，good diversity and complexity，which laid the foundation for preparation VHHs against interested antigens.

Camelusbactrianus；variable domain of heavy chain of heavy chain antibody (VHH)；yeast two-hybrid system

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.025

2014-09-26

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272578)；西北農(nóng)林科技大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金(Z111021006)

胡湘云(1990-)，女，廣西南寧人，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病和基因工程抗體的研究，E-mail：821995274@163.com

*通信作者：楊增岐，教授，E-mail：yzq8162@163.com

Q789

A

0366-6964(2015)06-1071-06