HPLC法測(cè)定有柄石韋及華北石韋中綠原酸和木犀草素的含量及不同浸提物的指紋圖譜分析

高 貝，程丹丹，辛?xí)詡?，高德?/p>

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

HPLC法測(cè)定有柄石韋及華北石韋中綠原酸和木犀草素的含量及不同浸提物的指紋圖譜分析

高 貝，程丹丹，辛?xí)詡?，高德?

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

目的:通過(guò)HPLC法對(duì)有柄石韋及華北石韋中綠原酸和木犀草素含量的測(cè)定，以控制石韋藥材質(zhì)量,建立石韋藥材中綠原酸及木犀草素的含量測(cè)定方法，同時(shí)對(duì)有柄石韋及華北石韋中綠原酸及木犀草素的含量進(jìn)行比較以及對(duì)不同浸提物的指紋圖譜進(jìn)行分析。方法:用hypersil ODS-2柱,流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸水(9 ∶91), 檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，流速1 mL·min-1。結(jié)果:各峰可較好的分離，有柄石韋中綠原酸的含量可達(dá)到1.51%。結(jié)論:該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，具有較好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性，可用于有柄石韋及華北石韋中綠原酸和木犀草素含量測(cè)定。

HPLC; 有柄石韋；華北石韋; 綠原酸；木犀草素

石韋為水龍骨科(Polypodiaceae)植物廬山石韋[Pyrrosiasheareri(Bak.)Ching]、石韋[Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell]和有柄石韋[Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching]的干燥葉[1]。生于裸露干旱巖石上，海拔250～2 200 m。綠原酸具有廣泛的生物活性，可以有效清除體內(nèi)的自由基，具有較強(qiáng)的抑制突變，抗癌，抑菌的作用，能利膽、降壓、顯著增加胃腸蠕動(dòng)和促進(jìn)胃液分泌[2]；木犀草素具有抗腫瘤、抗應(yīng)變性、抗病毒、抗炎、抗氧化、和保護(hù)細(xì)胞的作用，對(duì)白血病細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞生物學(xué)功能有影響[3]。華北石韋未被藥典收錄到石韋藥材中，HPLC為藥典規(guī)定的石韋中綠原酸含量測(cè)定方法。本研究主要采用高效液相色譜法對(duì)兩種石韋中綠原酸和木犀草素的含量測(cè)定，以期為藥用石韋擴(kuò)大資源，合理開(kāi)發(fā)利用，控制藥材質(zhì)量及進(jìn)一步化學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要試藥

對(duì)照品綠原酸(上海金穗生物科技有限公司；20130916)，木犀草素(上海金穗生物科技有限公司；20131021)乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。 有柄石韋，華北石韋(采自膠東，2013.09.06)經(jīng)高德民副教授鑒定，保存于山東中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館。

1.2 儀器

浙大智達(dá)N2000高效液相色譜儀(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)；萬(wàn)分之一分析天平(上海菁海儀器有限公司)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 Shim-pack VP-ODS (4.6 mm×250 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈-0.5% 磷酸水(9 ∶91);檢測(cè)波長(zhǎng)0～45 min 為 326 nm，流速為 1.0 mL·min；柱溫為 25 ℃[1，8]。

2.2 溶液的制備[1]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備[4,5]

精密稱取綠原酸、木犀草素對(duì)照品各5 mg，加 50%甲醇溶解,分別制成 0.5,0.25 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取有柄石韋及華北石韋粉末(過(guò)2號(hào)篩)1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇40 mL,密塞,稱重,超聲處理45 min,取出,放冷,再稱重,用50%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得，備用。精密稱取有柄石韋粉末1 g,按以上方法，制備水，甲醇，乙醇(50%)，丙酮浸提物[6-7]。

2.3 線性關(guān)系考察試驗(yàn)

分別精密量取上述綠原酸，木犀草素對(duì)照品溶液2,5,10,15,20μL進(jìn)樣[8]，以色譜峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量(X)進(jìn)行回歸，木犀草素的線性回歸方程為Y=3 634 201X+26 587，r=0.999 9，線性范圍為0.029 7～0.42 μg。綠原酸的線性回歸方程為Y=25 089X+840 462，r=0.999 8，線性范圍為0.018～0.89 μg。

2.4 精密度試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得木犀草素的峰面積RSD為0.75%，綠原酸的峰面積RSD為0.45%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好[9-10]。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取

取上述對(duì)照品溶液20 μL分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定木犀草素的峰面積RSD為1.98%，綠原酸的峰面積RSD為0.87%表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定[11]。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同批有柄石韋及華北藥材，按供試品制備方法配制6份，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定木犀草素，綠原酸的峰而積RSD分別為1.98%，1,69%，表明該方法的重現(xiàn)性較好[12]。

2.7 樣品測(cè)定

按上述待測(cè)溶液的制備方法制備溶液,按綠原酸和木犀草素測(cè)定色譜條件,對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)定[1],外標(biāo)法計(jì)算含量，得到回歸方程為：綠原酸Y=25 089X+840 462,r=0.999 0;木犀草素Y=11 651X+10r=0.999 7。利用面積歸一化法對(duì)1～8號(hào)物質(zhì)進(jìn)行相對(duì)含量測(cè)定。

2.8 結(jié)果

圖1 有柄石韋(A)、華北石韋(B)、對(duì)照品(C)、陰性對(duì)照(D)的HPLC指紋圖譜

圖2 有柄石韋水(A)，甲醇(B)，乙醇(50%)(C),丙酮(D)浸出物HPLC指紋圖譜

表1 有柄石韋、華北石韋中綠原酸及木犀草素的含量

圖3 有柄石韋不同浸出物中各峰處物質(zhì)的相對(duì)含量

2.8.1 結(jié)果分析

有HPLC指紋圖譜可知各峰分離效果較好,與相鄰峰能達(dá)到基線分離,無(wú)重疊峰,R>2.0,保留時(shí)間合適,穩(wěn)定,重現(xiàn)性好。

2.8.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證該工藝的精密性，可重復(fù)性和穩(wěn)定性，結(jié)果無(wú)顯著差異，結(jié)果精密度良好，方法穩(wěn)定，準(zhǔn)確，可靠。

3 討 論

結(jié)果表明有柄石韋和華北石韋所含化學(xué)成分的種類基本相似，但各成分的含量有很大差異。HPLC指紋圖譜分離度較好(圖1)，穩(wěn)定可靠,建立了石韋中綠原酸與木犀草素的HPLC測(cè)定方法。可作為石韋近似種的鑒別及進(jìn)一步的成分研究提供基礎(chǔ)材料。有柄石韋和華北石韋中綠原酸的含量均達(dá)到藥典要求(不得少于0.20%)，有柄石韋中綠原酸的含量明顯高于華北石韋，但木犀草素的含量明顯低于華北石韋(表1)。單從綠原酸含量可以考慮將其歸入藥用石韋，但仍需做進(jìn)一步的藥效，藥理及臨床實(shí)驗(yàn)。這為中藥石韋的深入開(kāi)發(fā)研究提供參考，也為藥材鑒別提供了科學(xué)依據(jù)[13-14]。

有柄石韋不同浸提物中的成分及含量存在很大差異，化合物1在甲醇和乙醇浸提物中含量較高，5，6在丙酮，8在水提物中相對(duì)含量較高，2, 5在水提物中相對(duì)含量較少，4在乙醇提取物中的含量最低，在其它提取物中相差不大，7在各提取物中所咱的相對(duì)含量沒(méi)有明顯差別(圖2，3)。這為進(jìn)一步有柄石韋的提取，分離及有效成分分析提供基礎(chǔ)材料[15]，也為石韋藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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Determination of Chlorogenic Acid and Mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching by HPLC andAnalysis of Fingerprints from Different Extraction

Gao Bei, Cheng Dandan, Xin Xiaowei, Gao Demin

(School of Pharmacy, Shandong University of TCM, Jinan 250355, China)

Objective:HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching，for quality control, establish the content determination method and the comparison in content of chlorogenic acid and mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching, at the same time, analyze fingerprints from different extraction.Method:With ODS-C18column, mobile phase acetonitrile-phosphate (0.5% ) (9:91), wavelength 326 nm, flow rate 1 mL·min-1.Results:The peaks can be good separated, the content of chlorogenic acid can reach 1.51% inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching.Conclusion:The method is simple and good reproducibility, and can be used for determination of chlorogenic acid and mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching.

HPLC;Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching；Pyrrosiadavidii(Baker) Ching; chlorogenic acid； mignonette

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.01.006

2014-07-12

山東中醫(yī)藥大學(xué)2012年SRT資助項(xiàng)目。

R284.1

A

1006-9690(2015)01-0019-03