慢性中耳炎及膽脂瘤中細(xì)菌生物膜的觀察

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科病院(西安710004)

王 冰 成 穎 許 珉▲

▲通訊作者

慢性中耳炎及膽脂瘤中細(xì)菌生物膜的觀察

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科病院(西安710004)

王 冰 成 穎 許 珉▲

目的：通過掃描電子顯微鏡觀察慢性化膿性中耳炎、分泌性中耳炎及中耳膽脂瘤中耳腔病變組織中細(xì)菌生物膜存在情況。方法：收集手術(shù)治療慢性化膿性中耳炎11例,分泌性中耳炎8例,中耳膽脂瘤9例,術(shù)中中耳腔內(nèi)病變組織為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本(其中肉芽組織11例、分泌液8例、膽脂瘤9例)；所得標(biāo)本進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察其細(xì)菌生物膜存在情況。結(jié)果：肉芽組織、膽脂瘤中細(xì)菌生物膜檢出率較高,分泌性中耳炎中稍低；近6個(gè)月有流膿病史者檢出率低于近6個(gè)月無流膿病史者；膽脂瘤伴感染者檢出率遠(yuǎn)高于不伴感染者。結(jié)論：細(xì)菌生物膜確存在于慢性化膿性中耳炎、中耳膽脂瘤，慢性分泌性中耳炎存在率相對(duì)較低；這可能是導(dǎo)致抗生素耐藥、病情遷延不愈或反復(fù)急性發(fā)作的原因。

細(xì)菌生物膜(Bacterial biofilm,BF)是細(xì)菌自行集合的多細(xì)胞復(fù)合體，由細(xì)菌和自身及宿主共同分泌的細(xì)胞外多糖機(jī)制共同組成[1]，主要通過對(duì)抗機(jī)體免疫及產(chǎn)生抗生素耐藥等機(jī)制導(dǎo)致慢性感染的遷延不愈或反復(fù)急性發(fā)作。目前認(rèn)為99%的細(xì)菌以生物膜的形式存在，美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心估計(jì)至少65%的人類細(xì)菌感染與生物膜有關(guān)[2]。在耳鼻咽喉相關(guān)疾病中,已有研究表明慢性扁桃體炎、腺樣體炎、慢性鼻-鼻竇炎、中耳炎、膽脂瘤及耳科植入器械等均與細(xì)菌生物膜有關(guān)[3]。然而,而慢性化膿性中耳炎(CSOM)和慢性分泌性中耳炎(COME),中耳膽脂瘤,細(xì)菌生物膜研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)慢性中耳炎、膽脂瘤中耳腔中細(xì)菌生物膜的存在情況進(jìn)行觀察,了解其分布差異性。

對(duì)象與方法

1 對(duì) 象 慢性化膿性中耳炎11例，膽脂瘤9例，分泌性中耳炎8例，術(shù)中取鼓竇乳突腔或上鼓室病變組織(11例肉芽組織、9例膽脂瘤、8例分泌液)為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。慢性化膿性中耳炎組根據(jù)近6月有無流膿病史分為兩個(gè)亞組，膽脂瘤組根據(jù)是否伴發(fā)感染分為兩個(gè)亞組。

2 方 法 術(shù)中所得標(biāo)本立即置于2.5%戊二醛固定,依次用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇浸泡,梯度脫水，每次5min,脫水后依次放入30%、50%、70%的醋酸異戊酯液中浸泡各10min,后置于100%醋酸異戊酯中20min充分置換,在體積分?jǐn)?shù)100%二氧化碳?xì)怏w中臨界干燥1h,離子濺射表面固定鍍膜,所得標(biāo)本進(jìn)行SEM觀察。

3 掃描電鏡結(jié)果判定 掃描電鏡下同時(shí)觀察到以下三個(gè)證據(jù)即認(rèn)為存在細(xì)菌生物膜：①細(xì)菌大小及形態(tài)的物質(zhì)；②連接于細(xì)菌球之間的不定形的多糖組織；③附著于組織表面[4]。

結(jié) 果

掃描電鏡下,可見大面積聚集細(xì)菌及連接于細(xì)菌之間的纖維樣組織(圖1、4),即認(rèn)為大量生物膜存在；如僅局部可見細(xì)菌及纖維樣組織,或纖維樣組織極其稀薄(圖2、5),即認(rèn)為存在少許細(xì)菌生物膜；如組織表面光滑(圖3、7)或組織表面僅可見少許散在細(xì)菌無纖維樣組織(圖6、9)即認(rèn)為無細(xì)菌生物膜存在。前兩者均被認(rèn)定為在組織中觀察到細(xì)菌生物膜。

圖1 掃描電鏡下可見大量細(xì)菌聚集，有纖維樣組織連接于細(xì)菌之間，箭頭所指為纖維狀物(2000×)；圖2 掃描電鏡下可見散在細(xì)菌生物膜，其余組織表面光滑(5000×)；圖3 肉芽組織表面光滑，未見細(xì)菌或生物膜，箭頭所指為肉芽組織(3000×)。

圖4 掃描電鏡下可見膽脂瘤表面大量細(xì)菌聚集，大量纖維樣物連接于細(xì)菌之間，箭頭所指為細(xì)菌(4000×)；圖5 膽脂瘤表面可見少許纖維樣物連接于細(xì)菌之間，箭頭所指為纖維樣物(1500×)；圖6 膽脂瘤表面可見散在細(xì)菌分布，未見細(xì)菌生物膜，箭頭所指為細(xì)菌，星號(hào)標(biāo)記為膽脂瘤角化物(1000×)。

圖7 分泌液表面可見大量纖維樣物附著，其間可見細(xì)菌聚集，箭頭所指為纖維物(2500×)；圖8 可見散在細(xì)菌被細(xì)胞外多糖基質(zhì)包裹，箭頭所指為細(xì)胞外多糖基質(zhì)(5000×)；圖9 分泌液表面僅可見數(shù)個(gè)散在細(xì)菌，箭頭所指為細(xì)菌(4000×)。

慢性化膿性中耳炎組11例中有8例觀察到細(xì)菌生物膜，檢出率8/11(72.7%)，膽脂瘤組9例6例觀察到細(xì)菌生物膜，檢出率6/9(66.7%)，分泌性中耳炎組8例中4例觀察到細(xì)菌生物膜，檢出率4/8(50%)。慢性化膿性中耳炎亞組中，近6月有流膿病史者8例中5例檢出，檢出率5/8(62.5%)；停止流膿超過6月者3例，均觀察到大量細(xì)菌生物膜，檢出率100%。膽脂瘤亞組中，膽脂瘤伴發(fā)感染者6例中5例觀察到細(xì)菌生物膜，檢出率5/6(83.3%)；膽脂瘤不伴感染者3例中僅1例觀察到少許細(xì)菌生物膜，檢出率1/3(33.3%)。(見附表)。

附表 不同類型中耳炎細(xì)菌生物膜檢出率表

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持細(xì)菌生物膜在耳鼻咽喉疾病中發(fā)揮重要作用這一假設(shè)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，慢性化膿性中耳炎組11例中有8例觀察到細(xì)菌生物膜，檢出率8/11(72.7%)，膽脂瘤組9例6例觀察到細(xì)菌生物膜，檢出率6/9(66.7%)。這一結(jié)果與國(guó)外學(xué)者研究較為接近，Lee等[5]對(duì)CSOM患者中耳粘膜BF檢出率為6/10(60%)；Chole等[6]發(fā)現(xiàn)膽脂瘤患者BF檢出率為16/24(66.7%)，動(dòng)物模型中膽脂瘤BF檢出率為21/24(87.5%)；Kaya等[7]在其研究中發(fā)現(xiàn)CSOM的細(xì)菌生物膜存在率為7/10(70%)，膽脂瘤中存在率為8/13(61.5%)；Gu等[8]研究中發(fā)現(xiàn)CSOM細(xì)菌生物膜檢出率92%，膽脂瘤組為85%。根據(jù)以上結(jié)果，有學(xué)者提出細(xì)菌生物膜可能是慢性中耳炎致病的重要因素之一，這可解釋嚴(yán)重的抗生素耐藥問題，Mah等[9]認(rèn)為，處于細(xì)菌生物膜里層的細(xì)菌對(duì)環(huán)境變化多不敏感，尤其是對(duì)抗菌藥物的敏感性顯著降低。Schauder等[10]發(fā)現(xiàn)處于細(xì)菌生物膜內(nèi)層的細(xì)菌對(duì)抗生素完全不敏感，這使感染反復(fù)發(fā)作，難以控制，同時(shí)長(zhǎng)期低效度的抗生素環(huán)境使得內(nèi)層菌變異而產(chǎn)生耐藥性。而細(xì)菌生物膜與損傷部位的結(jié)合導(dǎo)致炎癥遷延不愈。

慢性分泌性中耳炎組8例中4例觀察到細(xì)菌生物膜，檢出率4/8(50%)，而國(guó)外學(xué)者報(bào)道分泌性中耳炎患者中耳腔粘膜細(xì)菌生物膜檢出率均較本實(shí)驗(yàn)結(jié)果高：Pinar等[11]在OME患兒中耳粘膜發(fā)現(xiàn)BF檢出率為46/50(92%)；Hall-Stoodley等[12]在16例細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的OME中耳粘膜中BF檢出率為9/16(56.3%)。出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大可能與取材部位及檢測(cè)手段有關(guān)。而在慢性化膿性中耳炎兩個(gè)亞組中，停止流膿半年以上者3例中均觀察到大量典型細(xì)菌生物膜，而近6個(gè)月有流膿病史者細(xì)菌生物膜檢出率較低，Kaya等[7]發(fā)現(xiàn)CSOM檢出率為70%而慢性非化膿性中耳炎檢出率為54.5%；Akyildiz等[13]通過直接顯微鏡和透射顯微鏡觀察中耳腔粘膜細(xì)菌生物膜，結(jié)果顯示近期有耳漏癥狀組細(xì)菌生物膜存在率明顯高于無耳漏組，而無耳漏組與對(duì)照組人工耳蝸移植組并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差較大，考慮為本實(shí)驗(yàn)取材為炎癥較重的肉芽組織，并且應(yīng)用相對(duì)認(rèn)可的掃描電子顯微鏡觀察。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與BF的生物學(xué)行為一致。BF處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，病變組織內(nèi)細(xì)菌以生物膜方式存在，疾病處于靜止期，而當(dāng)身體抵抗力下降或遭受外來感染時(shí)，生物膜這個(gè)三維立體的結(jié)構(gòu)中細(xì)菌飽和，在密度感應(yīng)系統(tǒng)及其他因素影響下，釋放一部分細(xì)菌，形成感染的急性發(fā)作，浮游菌遇到適宜表面繼續(xù)附著、發(fā)展、成熟，形成循環(huán)往復(fù)[14]。中耳膽脂瘤兩個(gè)亞組中伴發(fā)感染組細(xì)菌生物膜檢出率高，不伴發(fā)感染組僅1例觀察到少許纖維樣組織包裹細(xì)菌球，Saunders等[15]在其研究中也發(fā)現(xiàn)不伴發(fā)感染的膽脂瘤幾乎未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物膜，而伴發(fā)感染或急性發(fā)作的膽脂瘤細(xì)菌生物膜存在率極高，甚至鱗狀上皮表面亦可觀察到。

結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持細(xì)菌生物膜存在于慢性化膿性中耳炎、中耳膽脂瘤及慢性分泌性中耳炎這一假設(shè)，認(rèn)為細(xì)菌生物膜在不同類型的慢性中耳炎中存在較為普遍，而慢性分泌性中耳炎中細(xì)菌生物膜存在相對(duì)較低，這可能是導(dǎo)致抗生素耐藥、病情遷延不愈或反復(fù)急性發(fā)作的原因。

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(收稿：2014-09-28)

中耳炎 伴滲出液中耳炎 中耳炎,化膿性 膽脂瘤 細(xì)菌 生物膜 顯微鏡檢查,電子

R764.21

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10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.007