HBV在卵巢組織及卵細胞中復制的實驗研究

陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科(西安710068)

金 燕 邱 婷 呂頤菲 閆春英 王 雪 劉貴生

HBV在卵巢組織及卵細胞中復制的實驗研究

陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科(西安710068)

金 燕 邱 婷 呂頤菲 閆春英 王 雪 劉貴生

目的：尋找尋找卵細胞感染HBV的直接證據(jù)及影響因素。方法：檢測卵巢及卵細胞中HBcAg、HBV DNA 和HBV mRNA的分布情況。研究血清中HBeAg陽性和HBV DNA水平與HBV感染卵巢及卵細胞的關(guān)系。結(jié)果： 在卵巢顆粒細胞和卵細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA分布。血清HBeAg與否和HBV DNA水平高低與卵巢及卵細胞中HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA陽性率無關(guān)。 結(jié)論：HBV可以在卵巢和卵細胞內(nèi)復制，這意味著被感染的卵細胞一旦受精成功就很有可能將HBV帶入胚胎發(fā)生垂直傳播。血清HBeAg與否和HBV DNA水平與卵巢及卵細胞感染HBV無關(guān)。

乙型病毒性肝炎(乙型肝炎)是一種嚴重危害人類健康的世界性疾病，截至目前全球約有20億人既往或持續(xù)感染HBV(乙肝病毒)，其中3.5～4億人為慢性HBV感染者。HBV母嬰傳播是造成HBV感染慢性化的主要原因。隨著孕期和新生兒注射乙肝免疫球蛋白(HBIG)和接種乙肝疫苗(HBVac)明顯降低了母嬰傳播率，但是仍有部分患者不能通過上述方法阻斷[1-3]。研究顯示,經(jīng)HBV卵細胞垂直傳播可能是主要原因,因此需要研究卵巢和卵細胞中的HBV復制活性以利于HBV母嬰傳播機制的深入探討。另一方面，既往的研究認為孕產(chǎn)婦HBV DNA高水平及HBeAg陽性是造成HBV母嬰傳播感染的主要因素，通過孕前、孕中降低HBV DNA水平和使HBeAg轉(zhuǎn)陰可以減少母嬰傳播的發(fā)生[4-5]。且有研究也發(fā)現(xiàn)HBV DNA病毒復制水平和血清HBeAg與肝外組織病變有明確相關(guān)性[6-7]。

本研究擬通過檢測卵巢及卵細胞中HBcAg、HBV DNA 和HBV mRNA的分布情況，分析HBV在卵巢組織中尤其是卵細胞中的復制情況。并進一步研究血清中HBeAg陽性和HBV DNA水平與HBV感染卵巢及卵細胞的關(guān)系，深入探討HBV經(jīng)卵細胞垂直傳播的機制。

材料和方法

1 研究對象 選擇2008年7月至2010年6月在西安交通大學第一附屬醫(yī)院和陜西省婦幼保健院因婦科疾病且患有慢性乙肝需要手術(shù)切除的50例患者的卵巢組織?；颊咂骄挲g38歲，婦科疾病分別為：卵巢囊腫18例，異位妊娠2例，卵巢畸胎瘤6例，子宮惡性腫瘤24例。同時選擇6例無乙肝病毒感染的卵巢組織作為陰性對照。所有乙肝患者均經(jīng)臨床診斷確診為慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎攜帶者，診斷符合以2000年全國病毒性肝炎學術(shù)會議(西安)修訂的慢性病毒性肝炎的診斷標準,并且所有患者未接受正規(guī)抗病毒治療。

所有患者在手術(shù)前于肘靜脈處抽取10ml靜脈血，分別用于血清HBV DNA定量檢測，和HBVM檢測。同時檢測患者血清中HAV、HCV、HDV和HIV抗體，排除有上述病毒的感染。

2 研究方法

2.1 血清HBV DNA定量檢測。

2.2 免疫組化檢測卵巢中HBcAg。

2.2.1 制片：新鮮卵巢組織置冰上，用DEPC水處理過的手術(shù)刀將標本切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小組織。沖洗-固定-脫水-透明和包埋-連續(xù)切片。

2.2.2 免疫組化：先用PBS沖洗；阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。與一抗反應，然后PBS洗3次每次各5min。與二抗反應,DAB顯色，脫水干燥。二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.2.3 陽性對照：選擇乙肝患者的肝穿標本，并通過病理學檢查診斷為慢性活動性肝炎的肝組織。

2.2.4 陰性對照：乙肝陰性的正常對照組的卵巢； PBS代替一抗；不加一抗的空白對照；用PBS代替二抗；不加二抗的空白對照。

2.2.5 結(jié)果判斷：雜交陽性信號主要位于胞漿中呈棕黃色。

2.3 mRNA原位雜交。

2.3.1 取材和切片標本的制備同前。

2.3.2 原位雜交:脫蠟，用蛋白酶稀釋液將胃蛋白酶溶解后滴在切片組織上，脫水; 預雜交；雜交：加雜交液20 μl/每張切片，含10ng探針，42℃過夜；DNA雜交95℃10min變性，使DNA雙鏈解開，迅速置于冰上1min，隨后42℃過夜 (16～18 h) ；終止；顯色， 復染，脫水、透明、封片。

2.3.3 陽性對照：選擇乙肝患者的肝穿標本，并通過病理學檢查診斷為慢性活動性肝炎的肝組織。

2.3.4 陰性對照：乙肝陰性的正常對照組的卵巢；雜交時未加入雜交探針；用PBS代替抗-DIG抗體；在雜交前用RNA酶將標本37℃過夜。

2.3.5 結(jié)果判斷:mRNA雜交陽性信號主要位于胞漿中呈紫蘭色，細胞核呈紅色。DNA雜交陽性信號位于胞核中呈棕黃色或黃色。

結(jié) 果

1 血清中HBV DNA和HBVM結(jié)果分析 根據(jù)檢測血清中HBV DNA定量的結(jié)果，將實驗組分為低復制組(HBV DNA定量≤104IU/ml)和高復制組(HBV DNA定量>104IU/ml)。同時根據(jù)HBeAg分為陽性組和陰性組。

2 卵巢中HBcAg檢測結(jié)果 以細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。再次在卵巢組織中卵母細胞和卵巢顆粒細胞的胞漿和胞膜中發(fā)現(xiàn)棕黃色HBcAg的陽性信號陽性率14%(7/50)，且分布位置無變化，見圖1。

3 卵巢中HBV DNA檢測結(jié)果 以細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。在實驗組中顆粒細胞和不同發(fā)育階段的卵母細胞胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)黃色HBV DNA的陽性信號，陽性率為12%(6/50)，見圖2。陰性對照、空白對照和替代對照均未顯示陽性信號。

4 卵巢組織中mRNA原位雜交結(jié)果 鏡下陽性表達判斷標準以細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)蘭紫色顆粒為陽性細胞。在卵巢顆粒細胞和卵細胞內(nèi)陽性信號。分布于細胞漿中，見圖3、4。陽性率為6%(3/50)。HBV mRNA原位雜交的陰性對照、空白對照和替代對照均未顯示陽性信號，見圖3。

5 卵巢中HBV標志物檢出與血清HBeAg和HBV DNA的關(guān)系 卵巢組織中檢測出HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA檢測結(jié)果與患者血清中HBeAg關(guān)系，見表1。用統(tǒng)計學軟件分析HBeAg與卵巢組織中各項乙肝標志物檢出率的關(guān)系后，結(jié)果顯示血清中HBeAg陽性組和陰性組之間卵巢中HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA陽性率均無明顯差異(P= 0.409、0.697、0.602)。

表1 HBcAg、HBVDNA 、HBV mRNA陽性信號的患者與血清中HBeAg關(guān)系

卵巢中HBcAg陽性陰性陽性率 卵巢中HBVDNA陽性陰性陽性率 卵巢中HBVmRNA陽性陰性陽性率HBeAg(+) 42014．3%42021．4%22214．3%HBeAg(-)2246．25%32312．5%1254%總數(shù)64412%74314%3476%

HBV DNA水平104IU/ml為分界限分為低復制組和高復制組，同樣用Fisher精確概率法分析，認為兩組間的卵巢中HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA陽性率的差異無明顯統(tǒng)計學意義(P= 0.674、1、1)。

表2 HBV DNA水平與HBcAg、HBVDNA 、HBV mRNA陽性率的關(guān)系

討 論

HBV雖是一種嗜肝病毒，但是近十年，人們已經(jīng)陸續(xù)在許多肝外組織中發(fā)現(xiàn)了乙肝病毒的存在的證據(jù)。本研究項目[8]在卵細胞和卵巢顆粒細胞中發(fā)現(xiàn)了HBV DNA存在和HBV蛋白表達。證實HBV可以感染卵巢中的卵細胞，但尚未有證據(jù)證實這些HBV片段具有復制活性，只有具有生物學活性的HBV DNA片段才能重新組裝成共價閉合環(huán)狀DNA并以此為模板轉(zhuǎn)錄mRNA，并與聚合酶一起被核衣殼包裹成核心顆粒并進而與外膜蛋白包裝成Dane顆粒并重新感染新的子代。這樣才有可能發(fā)生真正意義上的HBV經(jīng)卵細胞的母嬰垂直傳播。因此，進一步證實卵細胞中的HBV具有復制活性對深入研究HBV經(jīng)卵細胞垂直傳播的機制具有重要意義。

HBcAg在胞漿中合成后轉(zhuǎn)入核內(nèi)，在HBV DNA高表達時即行裝配，與病毒活躍復制密切相關(guān)，HBcAg的檢出也是HBV在卵細胞中復制和表達的標志。HBV DNA是明確的復制指標。HBV mRNA既是逆轉(zhuǎn)錄模板又是翻譯模板，因此HBV mRNA是HBV復制和表達的中間環(huán)節(jié)。本研究在卵巢組織及卵細胞中發(fā)現(xiàn)了HBcAg、HBV DNA和HBV RNA，分別從不同的層面證實在卵巢組織中尤其是卵細胞內(nèi)存在的HBV具有復制活性。我們有理由認為具有復制活性的HBV的卵細胞與正常人精子受精后，極有可能發(fā)生經(jīng)卵細胞母嬰傳播。

影響HBV母嬰傳播的因素眾多，如胎盤屏障作用、孕母及新生兒的遺傳易感性等。大部分研究結(jié)果證實孕產(chǎn)婦HBV DNA高水平及HBeAg陽性是造成HBV母嬰傳播感染的主要因素[9-10]。但在臨床中我們觀察到一些HBeAg陰性和HBV DNA低水平復制的孕婦即使在孕期接種HBIG也會免疫失敗造成母嬰傳播。本研究分析了血清HBeAg陽性和HBV DNA復制水平與卵巢中HBV陽性檢出率的關(guān)系，根據(jù)統(tǒng)計學得出提示血清HBeAg陽性和HBV DNA水平與卵巢中HBV的感染無明顯關(guān)系。而上述人群母嬰傳播的阻斷失敗發(fā)生的極有可能與卵細胞感染了HBV相關(guān)，也可以說，目前手段對阻斷經(jīng)卵細胞垂直傳播無效，這就要求我們通過深入研究HBV經(jīng)卵細胞垂直傳播機制尋找新的手段來降低HBV的母嬰傳播率。

總之，HBV不但可以在卵細胞和卵巢顆粒細胞內(nèi)復制而具有生物學活性。這就意味著一旦這些卵細胞受精成功發(fā)育為胚胎將很有可能在其內(nèi)復制并進一步發(fā)生垂直傳播。且這種復制與患者血清HBeAg陽性與否和HBV DNA水平高低與卵巢HBV感染率無關(guān)，因此，目前所采用阻斷措施對該途徑無效，需要進一步探索其機制來研究新的方法來控制經(jīng)卵細胞的HBV母嬰傳播。

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(收稿：2015-02-12)

乙型肝炎病毒 卵子 病毒復制 傳染病傳染，垂直

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.006