大鼠腦梗死模型神經(jīng)行為學(xué)評價的可靠性探討*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年神經(jīng)科(西安710004) 王 輝 王 蓉 何 婭 陳松盛

大鼠腦梗死模型神經(jīng)行為學(xué)評價的可靠性探討*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年神經(jīng)科(西安710004) 王 輝 王 蓉▲何 婭 陳松盛

目的：探討大鼠大腦中動脈阻塞模型(MCAO)神經(jīng)行為學(xué)評價的可靠性。方法：制備大鼠MCAO模型，清醒后即刻(D0)行神經(jīng)行為學(xué)評分及MRI成像，術(shù)后24h(D1)再次行神經(jīng)行為學(xué)評分,后斷頭取腦行TTC染色。結(jié)果：手術(shù)組12只大鼠均有程度不等的神經(jīng)缺損癥狀，DWI顯示大面積或局限性的缺血損傷區(qū)域,10只大鼠TTC染色可見程度不等的梗死病灶。相關(guān)分析提示D0時間點Longa評分、Garcia評分與根據(jù)磁共振彌散加權(quán)成像ADC圖計算的缺血梗死體積均無顯著相關(guān)。D1時間點Longa評分、Garcia評分與根據(jù)TTC染色計算的腦梗死體積均呈顯著相關(guān)。結(jié)論：在大鼠MCAO模型超急性期神經(jīng)行為學(xué)評分可靠性較差，術(shù)后24h神經(jīng)行為學(xué)評分與腦梗死嚴重程度相關(guān)性良好。

腦梗死研究最常用的是線栓法制備的大腦中動脈阻塞模型(MCAO),大腦中動脈供血區(qū)的神經(jīng)組織可能因缺血再灌注出現(xiàn)功能缺損，因此在研究過程中，通常借助神經(jīng)行為學(xué)評分判斷腦梗死后神經(jīng)損傷的程度以及之后修復(fù)的程度，但是神經(jīng)行為學(xué)評分是否能可靠地反應(yīng)神經(jīng)損傷及修復(fù)的程度？本研究通過比較大鼠大腦中動脈缺血再灌注過程中神經(jīng)行為學(xué)評分與磁共振彌散成像以及病理結(jié)果之間的相關(guān)性，探討大鼠MCAO模型神經(jīng)行為學(xué)評價的可靠性。

材料與方法

1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠20只,體重280～320g之間，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物隨機分為兩組：假手術(shù)組4只,手術(shù)組16只,術(shù)前飼養(yǎng)1周,術(shù)前12h禁食,自由飲水。

2 模型的制備 ①術(shù)前準備：4號手術(shù)線剪段,一端浸入溶化的固體石蠟約20mm深,迅速提出,豎直懸吊晾干,令石蠟自由順線身滴下,以保證包裹均勻，顯微鏡觀察其頭部呈均勻的橢圓小球。從線頭端起19mm處修正液標記。術(shù)前稱重,10%水合氯醛3.5ml/kg體重腹腔注射麻醉。②手術(shù)過程：參照Longa線栓法[1],麻醉后的大鼠仰臥位固定于鼠板上,頸部備皮消毒,正中切口,沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜,分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA),在CCA遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA,然后近心端結(jié)扎CCA、ECA,在距CCA分叉部4mm處剪一小口,將栓線插入到ICA,用眼科鑷輕推栓線,插入深度在19mm左右(修正液標記處到達ECA,ICA分叉處),感覺推進有阻力時,系牢ICA及CCA遠心端的備線以固定線栓。逐層縫合切口并消毒,剪短留在體外的線栓,阻斷后90min緩慢拔出線栓進行再灌注。術(shù)后將大鼠保持側(cè)臥位，60W白熾燈照射使肛溫保持在 37℃左右,注意吸痰保持呼吸道通暢。假手術(shù)組除了不插入線栓,其余操作同手術(shù)組。

3 模型評估 ①神經(jīng)行為學(xué)評分：均由3名觀察者采取單盲法進行評分并記錄,取3名觀察者評分的平均值作為得分。分別在手術(shù)清醒后即刻(記作D0)、術(shù)后24h(記作D1)進行2次評分。參考 Longa等[1]的 5分制評分標準進行神經(jīng)行為學(xué)評分。參考Garcia等[2]的運動感覺功能綜合評分。②磁共振檢查：使用 GE 3.0T超導(dǎo)型磁共振成像系統(tǒng)，選用50mm內(nèi)徑大鼠頭線圈。行快速自旋回波序列(FSE序列)頭顱T1WI、T2WI及平面回波成像(EPI序列)DWI冠狀位掃描。利用ADC圖計算腦缺血梗死體積。③組織病理學(xué)：評估結(jié)束后將大鼠斷頭取腦,將腦放入-20℃的冰箱20min使之變硬，取出后將其切成2mm厚的冠狀位切片，放入1%TTC中，37℃溫箱中孵育40min，取出觀察,用10%福爾馬林固定照相。每張切片的腦梗死體積=(該切片雙面梗死面積之和/2)×層厚,將各個切片腦梗死體積相加得到腦梗死總體積。

結(jié) 果

術(shù)后24h內(nèi)共有3只實驗組大鼠死亡，1只假手術(shù)組大鼠麻醉意外，排除后期病理染色中發(fā)現(xiàn)1只實驗組大鼠出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血，共有3只假手術(shù)組大鼠、12只手術(shù)組大鼠納入實驗。

1 神經(jīng)行為學(xué)評分 見附表。1～3號為假手術(shù)組。①Longa評分結(jié)果：假手術(shù)組D0及D1兩個時間點3只大鼠均未見明顯的神經(jīng)缺損癥狀。手術(shù)組D0時間點11只大鼠均可見程度不等的神經(jīng)缺損癥狀，1只大鼠未見神經(jīng)缺損癥狀(13號)，而相應(yīng)的ADC圖上卻可見大面積缺血灶。手術(shù)組D1時間點有9只大鼠可見程度不等的神經(jīng)缺損癥狀，3只未見神經(jīng)缺損癥狀，其中2只TTC染色未見明顯的梗死灶。② Garcia評分結(jié)果：假手術(shù)組D0時間點有2只大鼠可見輕微的神經(jīng)缺損癥狀，D1時間點有1只大鼠可見輕微的神經(jīng)缺損癥狀，但相應(yīng)的ADC圖及TTC染色均未見明顯的缺血損傷區(qū)域。手術(shù)組D0、D1時間點12只大鼠均可見程度不等的神經(jīng)缺損癥狀，其中2只TTC染色未見明顯的梗死灶。

附表 實驗大鼠的行為學(xué)評分及梗死體積

2 磁共振檢查 假手術(shù)組大鼠T1WI、T2WI、DWI均未見明顯的缺血損傷區(qū)域。手術(shù)組有7只大鼠可見較大面積的缺血損傷區(qū)域，其余5只大鼠可見缺血局限于丘腦、尾狀核或皮層下。

3 TTC病理染色 3只假手術(shù)組大鼠均未見腦梗死灶。手術(shù)組有10只大鼠TTC染色可見程度不等的腦梗病灶，2只大鼠未見梗死灶。

4 腦缺血梗死體積與神經(jīng)行為學(xué)相關(guān)性評價 D0時間點根據(jù)ADC圖計算的缺血梗死體積與D1時間點根據(jù)TTC染色計算的梗死體積明顯相關(guān)(r=0.820)。D0時間點Longa評分與根據(jù)ADC圖計算的缺血梗死體積無顯著相關(guān)(r=0.289)，Garcia評分與根據(jù)ADC圖計算的缺血梗死體積也無顯著相關(guān)(r=-0.730)(圖1)。D1時間點Longa評分與根據(jù)TTC染色計算的梗死體積顯著相關(guān)(r=0.821)，Garcia評分與根據(jù)TTC染色顯示的梗死體積也呈顯著負相關(guān)(r=-0.829)(圖2)。

圖1 手術(shù)組大鼠D0時間點Longa評分、Garcia評分與根據(jù)ADC圖計算的缺血梗死體積的散點圖

圖2 手術(shù)組大鼠D1時間點Longa評分、Garcia評分與根據(jù)TTC染色計算的梗死體積的散點圖

討 論

線栓法制備的大鼠MCAO模型是腦梗死研究中最常用的動物模型,多數(shù)研究者運用神經(jīng)行為學(xué)方法對大鼠MCAO模型進行評價,作為判斷模型是否成功以及干預(yù)是否有效的依據(jù)之一。Bederson等[3]認為,大鼠MCAO造模后24h,神經(jīng)行為學(xué)評分與大面積腦梗死的梗死體積相關(guān),但與局限于尾狀核和皮層下的局限性腦梗死的梗死體積無明顯相關(guān)性。Rogers等[4]發(fā)現(xiàn),在60min大腦中動脈阻塞和永久性大腦中動脈阻塞兩組動物模型中，盡管腦梗死體積有顯著差別，神經(jīng)功能評分卻沒有明顯的差異。Chauveau等[5]研究認為在腦梗死的急性期神經(jīng)行為學(xué)評分不能用于判斷腦梗死的嚴重程度。

本研究中也發(fā)現(xiàn)了大鼠神經(jīng)功能評分與病理結(jié)果不一致的情況,D0時間點第13號大鼠Longa評分為0，Garcia評分為14分,而DWI及TTC染色均提示大面積腦梗死。相關(guān)分析也顯示,D0時間點,神經(jīng)行為學(xué)評分與腦梗死體積無明顯相關(guān)。D1時間點神經(jīng)行為學(xué)評分與腦梗死體積顯著相關(guān)。

腦梗死超急性期神經(jīng)行為學(xué)評分與病理的不一致,考慮可能的原因有：①MCAO手術(shù)過程中一部分線栓未能經(jīng)頸內(nèi)動脈足夠深入以阻斷大腦中動脈血流時，由于頸內(nèi)動脈的分支脈絡(luò)膜前動脈被阻塞也能夠引起神經(jīng)功能的改變，此時神經(jīng)功能評分的可靠性受到干擾；②手術(shù)過程中線栓反復(fù)操作刺激血管內(nèi)膜導(dǎo)致短暫性腦缺血發(fā)作；③而同樣為頸內(nèi)動脈分支的下丘腦動脈供血區(qū)梗死可以表現(xiàn)為無或有輕度姿勢反射異常；④除了皮質(zhì)損害，重要的皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)( 尤其是纖維傳導(dǎo)束所經(jīng)過的結(jié)構(gòu)) 受損同樣能夠出現(xiàn)神經(jīng)功能的異常；⑤急性期缺血半暗帶的存在，加大了行為學(xué)與病理不一致的可能；⑥簡單的神經(jīng)行為學(xué)評分標準主要側(cè)重于運動功能的檢查，不能全面地反應(yīng)神經(jīng)損傷的程度。在本研究中，D0時間點Longa評分與根據(jù)ADC圖計算的缺血梗死體積無相關(guān)，Garcia評分則與其有較弱的相關(guān)性。

MRI 具有空間分辨率高、軟組織顯像好等優(yōu)勢，是臨床診斷腦梗死最常用的影像學(xué)技術(shù)，能夠準確定位活體缺血發(fā)生的部位，而其中DWI序列能準確清晰顯示超急性期的腦梗死病灶。楊利霞等[6]研究則認為DWI技術(shù)在顯示急性期腦梗死的靈敏度方面較神經(jīng)功能缺失評分優(yōu)越。本研究在大鼠腦梗死的超急性期用MRI成像方法成像腦梗死病灶,并利用ADC圖計算缺血梗死體積，證實在腦梗死超急性期神經(jīng)行為學(xué)評分不能可靠地反應(yīng)腦梗死病變的嚴重程度。雖然MRI成像可用于評判MCAO模型,但由于其需時較多,而且會大大增加研究成本,實際研究中可行性較差。

TTC染色是腦梗死研究中常用的經(jīng)典的病理染色方法[7]。本研究在大鼠MCAO術(shù)后24h行大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及腦組織TTC染色證實,大鼠腦梗死后24h的神經(jīng)行為學(xué)評分與其梗死嚴重程度相關(guān)性良好。因此,建議在大鼠腦梗死實驗研究中,可選擇術(shù)后24h神經(jīng)行為學(xué)評分對MCAO模型進行評價。

神經(jīng)行為學(xué)評分作為簡便、經(jīng)濟的評價方法,在動物MCAO模型的研究中仍具有不可替代的作用,相信隨著評分方法的逐步完善,可靠性將逐漸提高。

[1] Longa E,Weinstein P,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)：84-91.

[2] Garcia JH,Wagner S,Liu KF,etal.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.Statistical validation[J].Stroke,1995,26(4)： 627-634.

[3] Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,etal. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of neurologic examination[J].Stroke,2000,17(3)：472-476.

[4] Rogers DC,Campbell CA,Stretton JL,etal. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat[J].Stroke,2010,28(10)：2060-2065.

[5] Chauveau F,Cho TH,Riou A,etal. Does acute behavioral testing reflect successful ischemia in rats with transient middle cerebral artery occlusion[J].Int J Stroke,2012,7(6)：465-472.

[6] 楊利霞,賈文霄,丁 爽.DWI評價大鼠急性腦梗死模型制備的價值[J].中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2009,25(4)：536-539.

[7] Ashioti M,Beech JS,Lowe AS,etal. Multi-modal characterization of the neocortical clip model of focal cerebral ischaemia by MRI, behavior and immunohistochemistry[J].Brain Res,2007,1145：177-189.

(收稿：2014-10-16)

The reliability of behavioral testing in experimental rats model of ischemia stroke

Department of Elderly Neurology,The Second Affiliated Hospital of Xi’an

Jiaotong University(Xi’an 710004) Wang Hui Wang Rong He Ya et al

Objective：To assess the reliability of behavioral testing in experimental rats model of ischemia stroke. Methods：Sprague-Dawley rats were subjected to 90 min of MCAO,then were evaluated with behavioral testing and scanned with MRI after they woke up. The behavioral testing were repeated 24 h after operation,followed by sacrifice. The cerebral infarction were detected by TTC examination. Results：In operated group,twenty rats have neural function deficient in varying degrees, and demonstrated massive or focal high signal on DWI,ten of them showed red cerebral infarction lesions on TTC staining. The scores of behavioral testing were correlated with infarction size on TTC staining on D1, conversely, No correlation was found between the scores on D0 and infarction size on ADC map. Conclusion：The behavioral testing fails to evaluate the neurologic deficient in super acute period of cerebral infarction of rats. There are significant correlation between behavioral score and cerebral infarction size at 24 h after operation.

Cerebral infarction Neurobehavioral manifestations Diffusion magnetic resonance imaging Rat

*陜西省科技攻關(guān)項目[2006K13-G1(7)]

大腦梗塞 神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn) 彌散磁共振成像 大鼠

R743.32

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.003

▲通訊作者：西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院影像科