基于活細胞顯微技術的登革病毒膜融合實驗方法的建立及初步應用

李 潔，徐元宏

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽合肥 230022)

登革病毒(DENV)是一種小型包膜病毒，主要通過受體介導的內(nèi)吞作用以及隨著病毒包膜與宿主細胞內(nèi)涵體膜的融合進入細胞內(nèi)復制［1]。作為包膜病毒進入細胞并將基因組釋放進入細胞質(zhì)所必需的步驟，病毒—細胞膜融合過程是通過一種或者多種病毒表面蛋白即融合蛋白發(fā)生構象的變化得以觸發(fā)［2]。DENV與宿主細胞膜的融合是通過在內(nèi)涵體酸性pH環(huán)境誘導下包膜E蛋白的結構學重排來實現(xiàn)的［3]。人們已經(jīng)證實抑制病毒與宿主細胞膜融合是一種抗病毒中和作用機制［4]，因此深入分析抗體在蟲媒病毒與宿主細胞膜融合的作用，對于理解抗體的中和作用機制至關重要。

目前，人們對抗體是否具備膜融合抑制能力的研究主要采用兩種實驗方法:一種是傳統(tǒng)的膜融合抑制實驗，借助顯微鏡觀察抗體是否影響病毒—宿主細胞膜融合后合胞體的形成［5];另一種是脂質(zhì)體浮選實驗，用脂質(zhì)體模擬病毒敏感性細胞的細胞膜，最后通過脂質(zhì)體浮選對實驗結果進行分析［6]。前者只能通過肉眼觀察合胞體形成判斷結果，要求操作者具備豐富的經(jīng)驗，存在一定的主觀性;后者未采用活細胞，且實驗步驟復雜，操作不便。以上兩種實驗方法均不能對抗體的膜融合抑制能力進行定量分析。因此，我們借助Incell Analyzer 2000高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)建立一種基于活細胞顯微技術的膜融合實驗新方法，對登革病毒抗體在病毒—細胞膜融合過程中的作用進行實時、定量的分析計算，此方法同樣適用其他蟲媒病毒，為深入理解蟲媒病毒中和作用機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試劑 RPMI－1640，胎牛血清 FCS，購于Invitrogen公司;96孔微量細胞培養(yǎng)板及購自美國Corning Life Sciences公司產(chǎn)品;抗體9F12、4G2為澳大利亞昆士蘭大學傳染病研究中心(Australian Infectious Diseases Research Centre)惠贈，其中4G2單抗是一株針對DENV融合肽(Fusion loop)的商品化交叉抗體，能夠阻斷病毒—細胞膜融合［7]，將此抗體作為膜融合實驗的陽性對照。單抗9F12是一株針對DENV EDⅢ區(qū)的交叉中和抗體，傳統(tǒng)的膜融合實驗顯示此單抗具備抑制膜融合能力［5]，我們將此單抗用于膜融合實驗新方法的初步驗證。

1．1．2 病毒和細胞 實驗中病毒采用 DENV-2，New Guiea-C來自于南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院臨床檢驗中心;C6/36蚊子細胞購自ATCC。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) C6/36細胞用含10%FBS、20 mol·L－1HEPES、谷酰胺的 RPMI－1640 培養(yǎng)基于28℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)、擴增。

1．2．2 確定膜融合實驗介導病毒—細胞膜融合的最佳pH值 (1)用RPMI 1640生長培養(yǎng)基 (含有10%FBS，20 mmol·L－1HEPES 及谷酰胺)將 C6/36細胞(8×105個)接種至96孔微量培養(yǎng)板，置于28°C含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱過夜;(2)吸棄生長培養(yǎng)基后，將DENV2(MOI值為2)加入96孔板，28°C感染細胞2 h后棄去，加入RPMI 1640生長培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(200μL);(3)孵育48 h以后，用預先調(diào)整好不同pH值的25 mmol·L－1MES(用HCl調(diào)整 pH 至5．0、5．5、6．0、6．5、7．0、7．5)的無血清RPMI－1640將4G2及陰性對照單抗進行稀釋后加入細胞中(100μL)，每個稀釋度重復3個復孔;(4)將細胞置于40°C孵育，同時借助 Incell Analyzer 2000高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)進行連續(xù)實時監(jiān)測活細胞的狀態(tài)變化。

1．2．3 確定膜融合實驗的最佳觀察時間 pH值降低誘導病毒與宿主細胞發(fā)生膜融合以后，需要選取最佳觀察時間點，如過早則融合尚未完全發(fā)生，如過遲則正常細胞形態(tài)發(fā)生變化，影響結果分析。在確定實驗的最佳pH值后，進一步確定實驗的最佳觀察時間，實驗方法同“1．2．2”，在加入低 pH 值的抗體后，將細胞置于40°C預熱的Incell Analyzer 2000儀器中，設置為每隔10 min拍攝細胞狀態(tài)，獲取不同時間點的病毒—細胞膜融合圖片數(shù)據(jù)，通過軟件進行分析比較，得出最佳觀察時間點。

1．2．4 膜融合實驗新方法測定中和抗體9F12的膜融合抑制能力 確定基于活細胞顯微技術膜融合實驗的最佳實驗條件后，將單抗9F12、4G2及無關陰性對照單抗進行梯度稀釋，進行膜融合實驗，檢測抗體抑制病毒—細胞膜融合的能力，并計算半數(shù)抑制濃度IC50。

1．3 儀器 Incell Analyzer 2000高內(nèi)涵細胞成像分析儀，美國GE公司;CO2細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司。

1．4 數(shù)據(jù)分析 用IN Cell investigator數(shù)據(jù)分析軟件對膜融合實驗結果進行定量分析，對拍攝圖片上的活細胞數(shù)量進行計數(shù)，最后借助GraphPadPrism 5．0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。最佳pH值確定實驗中，多個實驗組之間的數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13．0的單因素方差分析One Way ANOVA，多個實驗組之間的兩兩比較采用SNK－Q檢驗的方法。

2 結果

2．1 膜融合實驗中介導病毒—細胞膜融合的最佳p H值 蟲媒病毒與宿主細胞膜的融合是通過在內(nèi)涵體酸性pH環(huán)境誘導下實現(xiàn)的，其中pH值的下降起著關鍵性的作用。因此，最佳pH值的確定對于建立基于活細胞顯微技術的膜融合實驗新方法至關重要。pH值過高則膜融合的發(fā)生不夠充分，如過低則膜融合發(fā)生過快，不利于觀察及獲取數(shù)據(jù)。我們通過對 5．0、5．5、6．0、6．5、7．0 這 5 個不同 pH值條件下，各實驗組的膜融合現(xiàn)象進行觀察，并定量分析，最終選取膜融合實驗新方法最合適的pH值條件。如圖1A所示，除pH 7．0組，其他pH值條件均誘導了不同程度的病毒—細胞膜融合發(fā)生。pH 值5．0、5．5、6．5 條件下，陽性對照及無關單抗對照組均出現(xiàn)了膜融合現(xiàn)象，活細胞數(shù)量與未感染病毒的正常細胞數(shù)量相比均顯著降低(P＜0．05)，然而陽性4G2對照組與無關單抗組之間卻未顯示出顯著差異(P＞0．05)，說明這些pH值條件下不能觀察到3個實驗組之間的膜融合有明顯的差異。只有在pH值為6．0時，陽性對照組、無關單抗對照組及正常細胞組之間比較均有顯著的差異(P＜0．05)(圖1B)，說明在此條件下能夠觀察到陽性對照組、無關單抗組及正常細胞在膜融合實驗中存在顯著的膜融合差異，并最終進行分析計算。因此，在接下來的實驗中均采用pH 6．0作為膜融合實驗新方法的最佳pH條件。

圖1 膜融合實驗新方法的最pH值測定

圖2 膜融合實驗新方法的最佳時間點測定

2．2 膜融合實驗新方法最佳觀察時間點測定 在確定了膜融合實驗新方法的最佳pH值以后，需要選定最為合適的時間點觀察各個實驗組的病毒—細胞膜融合，并拍攝活細胞狀態(tài)圖片，最后通過軟件對活細胞數(shù)量進行計數(shù)并分析實驗結果。如圖2所示，在pH值降低介導膜融合開始后的20 min內(nèi)，未見明顯的病毒—細胞膜融合所致的合胞體形成;第30分鐘開始，無關單抗組出現(xiàn)明顯的膜融合，并隨著時間延長膜融合程度逐漸加劇，活細胞數(shù)目逐漸減少;在100 min的時候，結果顯示病毒—細胞膜融合已經(jīng)達到最大且一直持續(xù)至隨后的所有時間點。陽性對照4G2顯示出了較強的膜融合抑制能力，而正常細胞組未見明顯的膜融合。因此我們認為在pH值降低后100 min是觀察并分析膜融合發(fā)生的最佳時間點，在此時間點上既能觀察到充分的膜融合現(xiàn)象，正常細胞形態(tài)亦沒有受到影響。

2．3 單抗9F12的膜融合抑制活性測定 我們通過新建立的膜融合實驗體系對交叉中和抗體9F12的膜融合抑制活性進行測定，將4G2和一株無關單抗分別作為陽性對照、陰性對照。結果發(fā)現(xiàn)2株單抗確實如前期研究所示能夠阻斷病毒—細胞宿主膜融合，且呈現(xiàn)出劑量依賴模式(見圖3A)，9F12和4G2 半數(shù)抑制濃度 IC50分別為 0．02、0．03 g·L－1。在高濃度作用下(1．0 g·L－1)，單抗9F12組的細胞融合率為12．9%，高于陽性對照4G2組的7．6%。(見圖3B)。另外，無關單抗組及病毒對照組的細胞膜融合率均達到了90%以上，而正常細胞組未見到膜融合。

3 討論

登革病毒(DENV)廣泛流行于熱帶和亞熱帶的許多國家和地區(qū)，是亞洲和拉丁美洲一些國家兒童嚴重患病和死亡的主要原因之一［8]。DENV屬于黃病毒科的黃病毒屬，該種屬還包含了其他重要的人病原體如日本腦炎(Japanese encephalitis，JE)西尼羅(west nile，WN)黃熱病(yellow fever，YF)及蜱傳腦炎(tick borne encephalitis，TBE)等病毒［9]。作為一種小型包膜蟲媒病毒，DENV通過受體介導的內(nèi)吞作用以及隨著病毒包膜與宿主細胞內(nèi)涵體膜的融合進入細胞內(nèi)復制［10]。不同包膜病毒激活融合蛋白構象變化的因素并不相同，主要分為三種［1]:(1)低pH環(huán)境(蟲媒病毒、流感病毒);(2)與受體相互作用(副粘液病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒);(3)pH降低與受體作用同時存在(α逆轉(zhuǎn)錄病毒)。目前，世界上既無安全有效的登革病毒疫苗，亦無特異性的治療藥物［11－12]。大量的研究集中于抗病毒中和抗體的作用機制分析，中和抗體被證實能夠通過抑制病毒與宿主細胞膜融合而中和病毒感染。本研究建立了一種有別于傳統(tǒng)實驗方法的膜融合實驗新方法對抗體的膜融合抑制活性進行測定。此方法基于活細胞顯微技術，借助Incell Analyzer 2000高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)，既能實時觀察細胞膜融合的發(fā)生、發(fā)展，又能通過軟件對結果進行定量分析。經(jīng)過對膜融合實驗新方法進行優(yōu)化后，我們最終確立了實驗的最佳酸性環(huán)境及最佳數(shù)據(jù)讀取時間，分別為pH值6．0及環(huán)境酸性化后的100 min。

圖3 中和抗體9F12的膜融合抑制活性測定

我們將優(yōu)化的膜融合實驗新方法初步應用于2株中和抗體4G2、9F12，前期研究顯示二者具備抑制膜融合的能力。我們的新方法進一步證實了4G2和9F12均具備抑制病毒包膜與宿主細胞內(nèi)涵體膜融合的能力，且呈現(xiàn)劑量依賴模式，最終計算出精確的IC50。這一結果說明我們的基于活細胞顯微技術的膜融合實驗方法不僅能夠非常清晰地觀察DENV中和抗體是否具備膜融合抑制能力，還能計算出相應的半數(shù)抑制濃度，獲得精確的定量結果。

總之，本研究建立了一種基于活細胞顯微技術的膜融合抑制實驗新方法，對實驗方法進行優(yōu)化后證實此方法可應用于登革病毒中和抗體的膜融合能力測定，有助于深入了解抗體的中和作用機制。同時，該體系同樣適用于其他蟲媒病毒，為登革病毒及其他蟲媒病毒的相關研究奠定了基礎。

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