三葉青兩個肌動蛋白基因片段的克隆及其分析

黃連香，宋亞玲，向太和，孫 揚，武 盼，王 博

（杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州310036）

肌動蛋白（Actin）普遍存在于真核生物細胞中，是細胞骨架微絲的組成成分，參與細胞內(nèi)很多重要的生理活動，如細胞形狀的維持、細胞運動、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、細胞分裂等［1-2］.單體肌動蛋白為球蛋白，一般由375～377個氨基酸殘基組成［3］.閻隆飛等1963年首次報道高等植物中存在肌動蛋白［4］.在植物基因表達調(diào)控研究中，肌動蛋白基因作為一種管家基因常被廣泛用作分子內(nèi)標［5］.相關(guān)研究表明，高等植物肌動蛋白由多基因編碼，目前，百合［6］、茶樹［7］、刺五加［8］、馬鈴薯［9］等植物的肌動蛋白基因已被克隆和分析，但有關(guān)珍稀藥用植物三葉青（TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg）肌動蛋白基因的研究尚未見報道.

本研究克隆了三葉青2個肌動蛋白基因片段，并檢驗該基因在不同組織中的表達情況，研究結(jié)果報道如下.

1 材料與方法

1.1 材料

三葉青采自麗水市慶元縣山區(qū)野生種，種植于杭州師范大學塑料大棚中.

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取

利用上海Sangon公司的RNA 抽提試劑盒提取三葉青塊根中的RNA，按照操作說明進行.所得的RNA 溶液保存于-80 ℃用于后續(xù)實驗.

1.2.2 cDNA 第1鏈的合成

利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒進行三葉青cDNA 的合成，即：在Eppendorf管中依次加入總RNA（約200 ng／μL）2μL，Oligo（d T）18（0.5μg／μL）1μL，2×TS Reaction Mix 10μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，dd H2O（RNase-free）6μL，輕輕混勻，42 ℃孵育30 min后于85 ℃加熱5 min失活TransScript RT 酶.

1.2.3 PCR 擴增

根據(jù)GenBank 中擬南芥、煙草、大豆和水稻的肌動蛋白基因序列（GenBank 登陸號：AP002063.2、U60489.1、U60497.1、X16280.1和X15865.1等），通過Clustal W 軟件分析確定保守序列區(qū)域，再根據(jù)保守序列用Primer3 軟件設(shè)計1 組引物Act-P1：5′-GGAGAAGATCTGGCATCACA-3′和Act-P2：5′-CC TCCAATCCAGACACTGTA-3′，引物由上海Sangon公司合成.以上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板進行PCR 擴增，每35μL擴增體系包括：TaqDNA 聚合酶（2.5 U／μL）1μL，d NTP（10 mmol／L）2μL，引物（約10 pmol／μL）各2μL，cDNA 模板（50～100 ng／μL）1μL，dd H2O 23.5μL.擴增程序為：94℃預變性5 min后，按照94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s進行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?PCR 產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳約1 h（90 V）、溴化乙錠（EB）染色后，用美國Bio／Rad凝膠成像系統(tǒng)進行觀察分析和拍照.

1.2.4 目的片段的克隆和測序

利用上海Sangon公司試劑盒回收純化目的DNA 片段，連接到p MD19-T 克隆載體（Takara公司產(chǎn)品），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞并進行藍白斑篩選，重組質(zhì)粒采用酶切法進行鑒定，最后對陽性克隆進行測序.

1.2.5 擴展蛋白基因序列的生物信息學分析

使用NCBI在線分析軟件對測定的序列進行Blastn分析，對序列編碼的氨基酸進行Blastp同源性比較分析，同時利用Clustal W 軟件對氨基酸序列與其它物種的肌動蛋白氨基酸序列進行多重比較.

1.2.6 肌動蛋白基因的表達分析

對三葉青的葉、莖、普通根和塊根分別提取RNA，利用紫外分光光度法對提取的RNA 進行定量后，不同器官以等量的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后以Act-P1和Act-P2為引物進行RT-PCR分析，方法同前.

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青肌動蛋白基因的RT-PCR擴增

以三葉青RNA 逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，利用引物Act-P1、Act-P2進行PCR 擴增，電泳后出現(xiàn)兩條較清晰的條帶，大小約為800 bp和1 000 bp（分別命名為Th Act1和Th Act2）（圖1）.

圖1 三葉青肌動蛋白基因的RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR reaction of actin gene from Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

圖2 重組質(zhì)粒被Bam HⅠ＋SalⅠ酶切結(jié)果Fig.2 Results of recombinant plasmid digested with enzyme of Bam HⅠ＋SalⅠ

2.2 Th Act1 和Th Act2 基因的克隆和鑒定

PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接到克隆載體p MD19-T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選白色單菌落，提取其質(zhì)粒DNA，使用BamHⅠ＋SalⅠ對p MD19-Th Act1和p MD19-Th Act2重組載體進行雙酶切鑒定，酶切獲得的插入片段大小分別為800 bp和1 000 bp左右，與預期片段大小相符，結(jié)果表明獲得了陽性克?。▓D2）.

2.3 Th Act1 和Th Act2 基因序列分析

測序結(jié)果顯示，Th Act1（短片段）為867 bp（圖3），Th Act2（長片段）為1 079 bp（圖4），兩端引物序列位置在圖3和4中分別用方框標出.對兩個DNA 片段進行Blastn分析，并結(jié)合Blastp和ORFinder軟件分析，兩個基因均屬于NBD＿sugar-kinase＿HSP70＿actin superfamily家族，Th Act1（短片段）編碼252個氨基酸，Th Act2（長片段）編碼152個氨基酸.其中，Th Act1核苷酸序列與葡萄（GenBank登錄號AM465189.1）、黃褐棉（GenBank登錄號JF722026.1）和陸地棉（GenBank登錄號JF722036.1）等的相似性分別為92%、85%和85%，其編碼的蛋白質(zhì)與刺兒菜（GenBank 登錄號AEY77415.1）、月季（GenBank 登錄號BAF36000.1）和覆盆子（GenBank登錄號AED89635.1）等的相似性均為87%.而Th Act2核苷酸序列與葡萄（GenBank登錄號XM＿002265440.1）、海島棉（GenBank登錄號JF722033.1）和毛白楊（GenBank登錄號JX986590.1）等的相似性分別為91%、85%和85%，其編碼的蛋白質(zhì)與毛茛（GenBank 登錄號BAP28463.1）、魚腥草（GenBank登錄號ADN37687.1）和歐細辛（GenBank登錄號ADN37689.1）等的相似性分別為90%、93%和93%.進一步說明克隆到的兩個DNA 片段為肌動蛋白基因序列.

圖3 ThAct1 基因片段的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列Fig.3 The nucleotide sequences and the amino acid sequences of the Th Act1 gene

圖4 ThAct2 基因片段的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列Fig.4 The nucleotide sequences and the amino acid sequences of the Th Act2 gene

分別將推測的三葉青的兩個基因片段編碼的氨基酸序列與GenBank中登陸的其它物種Actin基因的氨基酸序列進行CluatlW 軟件的多重比較，發(fā)現(xiàn)ThAct1基因編碼的氨基酸中，有218個是保守的，6個是非保守氨基酸，而且與其它物種相比多出連續(xù)的28個氨基酸（圖3中用下劃線標出）；在Th Act2基因編碼的152個氨基酸中，僅有12個是非保守的氨基酸（圖4中用下劃線標出），這說明我們克隆到的Th Act1和

圖5 ThAct1 和Th Act2 在不同器官中的表達分析Fig.5 Expression analysis of ThAct1 and ThAct2 gene in different organs

不同物種中肌動蛋白的數(shù)目變化很大，除少數(shù)單細胞原生動物、藻類和酵母類外，所有的多細胞真核生物的肌動蛋白都由多基因家族編碼［10］，如黃瓜上至少有3條Actin基因［11］，棉花上至少含15個Actin基因［12］，這些不同的基因編碼不同類型的肌動蛋白異形體，與不同類型的肌動蛋白結(jié)合蛋白作用，Th Act2基因片段為Actin基因的高度保守區(qū)域.

2.4 ThAct1 和ThAct2 基因組織特異性表達分析

RT-PCR 半定量結(jié)果初步顯示：在莖、普通根和塊根中的Th Act1、Th Act2基因表達未見差異；但與葉相比，Th Act1的表達稍強，而Th Act2的表達稍弱.另外，在莖、普通根和塊根中，Th Act1表達比Th Act2強；但在葉中正好相反，Th Act1表達比Th Act2弱（圖5）.

3 討論

從而參與不同的生理活動和生命過程［13-14］.本研究通過1次PCR 擴增即獲得了2個三葉青的肌動蛋白基因，這可能與肌動蛋白基因是基因家族有關(guān)，在黃瓜中也有類似報道［11］.克隆到的2條肌動蛋白基因片段核苷酸序列和氨基酸序列與GenBank中收錄的其它生物的肌動蛋白有高度同源.相關(guān)研究表明，不同生物肌動蛋白具有高度保守性，其核苷酸殘基變化1%約需100萬年，暗示著肌動蛋白基因在進化過程中承受著較大的選擇壓力，在生物體內(nèi)執(zhí)行著重要的生物學功能［10］.本文中也證明了肌動蛋白作為看家基因的高度保守性，這與肌動蛋白作為細胞骨架的重要作用是息息相關(guān)的［13-14］.

另一方面，在基因的功能研究中，需要選用內(nèi)標基因作為參考，一個理想的內(nèi)標基因應(yīng)該在各種不同的細胞類型、不同發(fā)育階段采用不同處理方法時都能穩(wěn)定表達，穩(wěn)定的內(nèi)標是確定目標基因相對表達的基礎(chǔ)［15］.本文克隆獲得的2條肌動蛋白基因片段經(jīng)PCR 擴增在三葉青葉、莖、普通根和塊狀根中均得到正常表達，說明Th Act1和Th Act2基因可以作為三葉青的內(nèi)參基因來研究其它功能基因的表達.

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