杭州市狹葉小羽蘚遺傳多樣性研究

陸文怡，張 軍，潘江杰，張曉勤，吳玉環(huán)，薛大偉

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310036；2.山東省蒙陰第一中學(xué)，山東 蒙陰276200）

當(dāng)前，生物多樣性保護(hù)己經(jīng)引起各國(guó)政府的高度重視，生物多樣性包括其組成、分布、結(jié)構(gòu)和功能.遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是地球上所有生物攜帶的遺傳信息的總和，是生態(tài)系統(tǒng)多樣性和物種多樣性的基礎(chǔ).

狹葉小羽蘚（H.angustifolium）隸屬于羽蘚科（Thuidiaceae）小羽蘚屬（Haplocladium）.狹葉小羽蘚多著生背陰濕潤(rùn)的草叢下具土巖面、腐木或樹(shù)干基部，其植物體較大，呈羽狀分支、交織狀匍匐延伸，是良好的環(huán)境污染的指示植物［1-2，11］.關(guān)于杭州市苔蘚植物的報(bào)道，最早可追溯到1931年，國(guó)內(nèi)學(xué)者也曾在杭州市進(jìn)行苔蘚植物采集，但未見(jiàn)關(guān)于不同生境下苔蘚遺傳多樣性的研究.苔蘚植物分子遺傳多樣性研究國(guó)際上起步較晚，國(guó)內(nèi)涉及較少.

本研究以杭州市不同生境下狹葉小羽蘚為實(shí)驗(yàn)材料，用ISSR、RAPD、SRAP等分子標(biāo)記研究不同居群狹葉小羽蘚遺傳多樣性差異，分析其與環(huán)境因子的關(guān)系，為苔蘚植物在不同生境條件下的居群分子遺傳多樣性研究提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)采集杭州市不同生境下的狹葉小羽蘚居群，編號(hào)并保存.所采材料編號(hào)及生境見(jiàn)表1.

1.2 DNA提取及PCR 擴(kuò)增

取新鮮的狹葉小羽蘚植物體枝條，用無(wú)菌水沖洗，除去泥土等雜質(zhì)，用75%的乙醇浸泡5 min后取出，用無(wú)菌水沖洗干凈.將植物體放入研缽中加入液氮充分研磨后移至1.5 ml離心管.分別用SDS法，CTAB法和CTAB-Free法提取狹葉小羽蘚DNA.

表1 狹葉小羽蘚材料來(lái)源Tab.1 The source of H.angustifolium

PCR 總反應(yīng)體系20μL，模板DNA 1μl，2×Taq Master Mix 10μl（購(gòu)自SinoBio公司），引物2μl，dd H2O 7μl.RAPD-PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)椋?5 ℃4 min；94 ℃30 s，38 ℃45 s，72 ℃90 s，39個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存.SRAP-PCR 反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)椋?5 ℃4 min；94 ℃30 s，40 ℃45 s，72℃90 s，38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7min，4 ℃保存.ISSR-PCR 反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)椋?5 ℃5 min；94 ℃60 s，53℃40 s，72℃90 s，9個(gè)循環(huán)；94℃60 s，48℃40 s，72℃90 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存.PCR 產(chǎn)物用新型染料Dured染色，在1.2%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，120 V 下電泳1 h.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

瓊脂糖凝膠電泳獲得圖譜，根據(jù)各條譜帶的有無(wú)統(tǒng)計(jì)得到所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)：有DNA 擴(kuò)增帶的記為1（強(qiáng)帶和弱帶均記為1），無(wú)帶的記為0.將ISSR、SRAP、RAPD 三種標(biāo)記所得數(shù)據(jù)分別輸入EXCEL中，并建立相對(duì)應(yīng)的原始表征數(shù)據(jù)0-1矩陣.利用POPGENE v.1.31程序，計(jì)算分析居群遺傳多樣性指數(shù).用算術(shù)平均數(shù)的非加權(quán)成組配對(duì)法（unweighted pair-group method using arithmetic average，UPGMA）對(duì)居群間的遺傳距離進(jìn)行聚類分析，使用的軟件為NTSYS-pc software 2.0.

2 結(jié)果

2.1 苔蘚DNA提取方法的優(yōu)化

將三種DNA 提取方法進(jìn)行比較，采用SDS法提取的DNA 雖然含量較高，但其中含有較多的多酚類物質(zhì).而CTAB法優(yōu)點(diǎn)是提取的DNA 較純，含有雜質(zhì)少，但得到的DNA 含量很少.CTAB-Free法在加入CTAB抽提液之前加入CTAB-Free緩沖液，從而去除了總DNA 中大部分雜質(zhì)，采用這種辦法提取的DNA 條帶清晰明亮.

2.2 SRAP、ISSR、RAPD 引物的篩選

本實(shí)驗(yàn)從50條ISSR 隨機(jī)引物中篩選出11 條引物；90 條RAPD 引物中篩選出12 條引物；20 對(duì)SRAP引物全部用于擴(kuò)增反應(yīng).這些引物在居群中都具有良好的多態(tài)性，11條ISSR 引物共擴(kuò)增出27條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出2.45條帶；12條RAPD 引物共擴(kuò)增33條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出2.75條帶；20對(duì)SRAP引物共擴(kuò)增出67條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出3.35條帶.因此共有43個(gè)引物檢測(cè)到127條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出2.95條帶.擴(kuò)增片段長(zhǎng)度范圍為260～1700 bp（圖1）.

圖1 ISSR（A）、RAPD（B）、SRAP（C）引物的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of ISSR（A）、RAPD（B）、SRAP（C）

2.3 遺傳多樣性分析

對(duì)杭州市不同生境下8個(gè)居群間的遺傳多樣性分析表明：居群間的遺傳分化為35.98%.居群間的遺傳一致度（I）為0.3038～0.7658，平均值0.5305±0.033.說(shuō)明杭州市狹葉小羽蘚居群間表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性.

表2 杭州市8個(gè)狹葉小羽蘚居群間的遺傳一致度和遺傳距離Tab.2 The genetic consistency and genetic distance in between eight populations of H.angustifolium in Hangzhou

不同生境下8個(gè)居群的遺傳距離通過(guò)UPGMA 聚類分析得到樹(shù)狀圖（圖2）.由聚類圖可以看出8個(gè)居群可分為兩大類，其中4（LM）和7（XX）在一個(gè)進(jìn)化分支上，而1（HZNU）、2（ZUCC）、3（ZJU）、5（ZJUT）、6（ZJSU）和8（ZSTU）位于另外一個(gè)分支上，其中1（HZNU）和6（ZJSU），2（ZUCC）和3（ZJU）有較近的親緣關(guān)系.

圖2 8個(gè)狹葉小羽蘚居群間遺傳距離UPGMA樹(shù)狀圖Fig.2 Genetic distance UPGMA tree in between eight H.angustifolium

3 討論

生物多樣性保護(hù)的關(guān)鍵之一就是保護(hù)物種，更具體地說(shuō)就是保護(hù)物種的遺傳多樣性和進(jìn)化潛力，種內(nèi)遺傳多樣性或變異性越豐富，物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越大，其進(jìn)化的潛力就越大，有助于保護(hù)物種和整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，或可以減慢由于適應(yīng)和進(jìn)化所導(dǎo)致的滅絕過(guò)程［5］.本文以杭州市不同生境下8個(gè)狹葉小羽蘚巨群為實(shí)驗(yàn)材料，優(yōu)化了苔蘚DNA 提取的方法，運(yùn)用ISSR、RAPD、SRAP等技術(shù)研究不同居群狹葉小羽蘚遺傳多樣性差異.

根據(jù)三種不同的DNA 提取方法可以得出：改良后的CTAB-Free提取法使提取的基因組DNA 純度得到了有效的提升，PCR 效果最好，條帶明顯、清晰，因此采取CTAB-Free法提取苔蘚植物的基因組DNA 較好.CTAB-Free法改進(jìn)是在CTAB提取液加入前先加入CTAB-Free緩沖液，抽提出其中的雜質(zhì)，離心后去掉上清，加入CTAB（含β-巰基乙醇），β-巰基乙醇可以有效的抑制酚類物質(zhì)使DNA 褐變.這種方法提取的DNA 濃度和純度均比較高，凝膠電泳顯示無(wú)明顯降解現(xiàn)象.

采用篩選出的引物對(duì)DNA 樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明不同分子標(biāo)記的擴(kuò)增效果存在一定差異（圖1），ISSR 與SRAP的擴(kuò)增效果較RAPD 好，其中ISSR 的15對(duì)引物中成功擴(kuò)增出的有8條，SRAP引物可成功擴(kuò)增出全部DNA 樣品，RAPD 引物8對(duì)中僅2對(duì)能擴(kuò)增出條帶，并且ISSR 與SRAP的引物擴(kuò)增條帶清晰，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，便于觀察與統(tǒng)計(jì).而RAPD 引物擴(kuò)增條帶則很模糊，這將造成數(shù)據(jù)處理的誤差，從而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確.根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，這三種分子標(biāo)記中，最適于苔蘚植物的分子標(biāo)記為ISSR 與SRAP，RAPD 標(biāo)記效果較差可作為補(bǔ)充引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

植物的遺傳多樣性水平不一定與其地理分布的范圍具有必然聯(lián)系，它還與類群的起源、進(jìn)化歷史、生殖特點(diǎn)、生物特性、環(huán)境條件等很多因素有關(guān)［3］.Gregory等［4］用等位酶分析金發(fā)蘚（Polytrichumcommune）的遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)居群間具有較高的遺傳多樣性，認(rèn)為是孢子的散發(fā)受到了限制的緣故.李朝陽(yáng)等［6］采用RAPD 技術(shù)對(duì)梵凈山的尖葉擬船葉蘚（Dolichomitriopsisdiversiformis）14個(gè)居群進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，居群間遺傳多樣性較高，分析可能是尖葉擬船葉蘚的遺傳多樣性受小生境的影響較大，遺傳漂變和環(huán)境適應(yīng)可能是影響居群分化的主要原因.劉麗等［7］在分析鼠尾蘚（Myurocladamaximowiczii）的遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)不同居群間的遺傳距離和空間距離在一定范圍內(nèi)存在一定的相關(guān)性，但如果生存小環(huán)境相似，即使空間位置相距較遠(yuǎn)，也可能在分子水平上具有較高的相似性.而李倩影等［8］對(duì)上海市狹葉小羽蘚居群進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳分化分析，初步發(fā)現(xiàn)小羽蘚種群表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，居群間的變異程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于居群內(nèi)的變異程度，其主要原因是有限的基因流導(dǎo)致種群間出現(xiàn)較大的遺傳分化.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致，杭州市8個(gè)狹葉小羽蘚居群間的遺傳分化為35.98%，遺傳一致度為0.5305，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，這可能與其居群間的基因流有關(guān)，由于狹葉小羽蘚的孢子擴(kuò)散是居群間基因流動(dòng)的主要方式，孢子擴(kuò)散受阻，就會(huì)導(dǎo)致居群間的基因交流受阻，從而導(dǎo)致居群間分化程度明顯，遺傳多樣性較高.

研究表明，居群間的遺傳分化與環(huán)境因子的選擇和基因流的阻隔有關(guān)，而生態(tài)小環(huán)境的變異也可能導(dǎo)致不同種群間在遺傳結(jié)構(gòu)上的差異［6-7，10］.從表1和圖2中可以看出，人為干擾較大的6個(gè)居群（均位于市區(qū)的6所大學(xué)）遺傳距離相對(duì)較近，聚類圖上反映的是它們聚在一起；而兩個(gè)生態(tài)環(huán)境較好的居群，富陽(yáng)龍門古鎮(zhèn)（LM）和西溪濕地（XX），與上述6個(gè)居群遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，二者聚為一類，雖然二者空間距離較遠(yuǎn)，可能是由于這兩個(gè)居群為了適應(yīng)獨(dú)特的、類似的小生境而產(chǎn)生了適應(yīng)性變異，導(dǎo)致這兩個(gè)居群與其他居群間的分化更為強(qiáng)烈，這也說(shuō)明生境與基因互作導(dǎo)致的適應(yīng)性變異可能是影響居群分化的主要原因之一.

［1］安麗，曹同，俞鷹浩.上海市小羽蘚屬植物重金屬含量及其與環(huán)境的關(guān)系［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（8）：1490-1494.

［2］崔明昆.附生苔植物對(duì)城市大氣環(huán)境的生態(tài)監(jiān)測(cè)［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，21（3）：54-57.

［3］葛頌.酶電泳資料和系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)研究綜述［J］.武漢植物學(xué)研究，1994，12（1）：71-84.

［4］Derda G S，Wyatt R.Levels of genetic variation and its partitioning in the wide-ranging mossPolytrichumcommune［J］.Systematic Botany，1999，24：512-528.

［5］中國(guó)科學(xué)院生物多樣性委員會(huì).生物多樣性研究的原理與方法［M］.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

［6］李朝陽(yáng)，李菁，田向榮，等.梵凈山尖葉擬船葉蘚的遺傳多樣性分析［J］.植物分類與資源學(xué)報(bào)，2008，30（2）：168-172.

［7］劉麗，朱永青，王幼芳.鼠尾蘚不同居群間形態(tài)及RAPD分析［J］.云南植物研究，2006，28（6）：570-574.

［8］李倩影，曹同，于晶，等.不同種群狹葉小羽蘚（Haplocladiumangustifolium）重金屬含量及遺傳多樣性［J］.上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，39（2）：194-199.

［9］Rohlf F J.NTSYS-pc 2.0 Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System［M］.New York：Exeter Software，1998.

［10］Turkington R，Harper J L.The growth，distribution and neighbour relationships ofTrifoliumrepensin a permanent pasture：I.Ordination，pattern and contact［J］.Journal of Ecology，1979，67：201-218.

［11］吳鵬程.苔蘚生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1998.