microRNA-21對肺癌A549細胞增殖和Smad7表達的影響

李 斌，潘躍銀，杜瀛瀛

microRNA-21對肺癌A549細胞增殖和Smad7表達的影響

李 斌，潘躍銀，杜瀛瀛

目的探討微小RNA-21（miR-21）對肺癌A549細胞中Smad7表達的調控和對肺癌A549細胞增殖的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)肺癌細胞系A549，經脂質體轉染miR-21模擬物和抑制物及陰性對照片段48 h后，采用Western blot、qRTPCR法檢測Smad7基因及蛋白的表達水平，MTT法檢測A549細胞增殖情況。結果轉染miR-21模擬物后Smad7的mRNA和蛋白表達量降低（P＜0.05），而轉染miR-21抑制物后Smad7的mRNA和蛋白表達量升高（P＜0.05）；MTT結果顯示轉染miR-21模擬物后細胞的增殖能力明顯增強（P＜0.05），而轉染miR-21抑制物后細胞增殖能力明顯減弱（P＜0.05）。結論通過下調miR-21可提高Smad7的mRNA和蛋白表達，進而抑制A549細胞的增殖。

肺癌；微小RNA-21；Smad7；增殖

肺癌是威脅人類健康最常見的惡性腫瘤之一，惡性死亡率逐年上升［1］。微小RNA（microRNA，miR）是近年來發(fā)現的一類長約19～22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其能與靶序列mRNA的3’非翻譯區(qū)結合，時序性調控基因表達，在腫瘤細胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要的調控作用［2］。文獻［3］報道，miR-21在肺癌細胞中高表達，但作用機制尚不清楚。研究［4］證實，miR-21通過作用于Smad7調控肺成纖維細胞的活化增殖。Smad7是轉化生長因子-β1／Smad信號通路負調控因子，抑制細胞活化增殖［5］。miR-21是否靶向調控Smad7表達，影響肺癌A549細胞增殖目前尚不十分清楚。該研究旨在探討miR-21對肺癌中Smad7表達的調控和A549細胞增殖的影響，以期為研究miR-21在肺癌中的作用以及肺癌基因治療新靶標開發(fā)提供前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑一抗Smad7購自美國Cell signal公司；β-actin購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；miR-21模擬物和抑制物、EzOmics miRNA qPCR Detection Primer試劑盒、EzOmics One-Step qPCR試劑盒購自美國Biomic公司；LipofectamineTM2000 Reagent、TRIzol Reagent購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、SYBRGreen qPCR Master Mix購自立陶宛MBI Fermentas公司；引物合成均由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng)人非小細胞肺癌A549細胞株購自中科院上海細胞庫。在含100 ml／L胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 μg／ml鏈霉素及2 mmol／L谷氨酰胺的RPMI1640細胞培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2全濕度培養(yǎng)。當細胞貼壁達80%～90%時，按5×105／ml的細胞密度接種于6孔板中。

1.3 瞬時轉染取對數生長期A549細胞進行轉染實驗。轉染前1 d，將A549細胞計數后，接種于24孔板，用無血清不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋待轉染。成熟miR-21抑制物、模擬物和其陰性對照由美國Biomic生物技術公司設計并合成。引物序列如下：miR-21模擬物正義鏈（sense）：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，反義鏈（antisense）：5′-AACAUCAGUCUGAUAAGCUAUU-3′，miR-21抑制物序列（sequences）：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′。將miR-21抑制物、模擬物和陰性對照與脂質體LipofectamineTM2000 Reagent混勻，室溫靜置20 min后，加入相應各孔細胞中，于37℃、5%CO2保溫箱孵育4～6 h，更換含血清RPMI1640，24 h和48 h后提取轉染后細胞的總RNA和總蛋白。

1.4 MTT比色法檢測細胞增殖設計分組：轉染miR-21抑制物組、轉染miR-21模擬物和陰性對照組。將處于對數生長期的各實驗組A549細胞胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸形成細胞懸液。用血球計數板進行細胞計數。鋪板細胞密度為1 500個／孔鋪于96孔板中，每組5個復孔，每孔100 μl，共5張96孔板，連續(xù)監(jiān)測5 d，鋪板過程中要確保每孔加入細胞數一致。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第2天開始，培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入10 μl MTT（5 g／L），無需換液，4 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO終止反應，振蕩器震蕩5～10 min使結晶充分溶解，酶標儀490 nm處測定吸光度（absorbance，A）值。

1.5 細胞蛋白質提取取轉染后細胞，加入蛋白裂解液400 μl，按1 ml裂解液加10 μl PMSF原則加入PMSF，混勻，在搖床上冰浴30 min。裂解完后，然后轉移裂解液至離心管中，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液分裝轉移至新的離心管中。

1.6 細胞RNA提取取轉染后細胞，加入Trizol 1 ml后充分混勻；加入氯仿0.2 ml，充分混勻，室溫下孵育10 min，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液至EP管；加入等體積異丙醇，-20℃助沉30 min，4℃、12 000 r／min離心10 min，棄上清液；75%乙醇（含DEPC水）洗滌沉淀1次，4℃、12 000 r／min離心5 min，棄乙醇層；真空干燥5～10 min，加DEPC水振蕩溶解RNA沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western blot法檢測Smad7的表達將提取的細胞蛋白定量，然后通過SDS-PAGE電泳分離，PVDF轉膜后封閉3 h，加入Smad7和β-actin一抗孵育過夜，然后加Smad7和β-actin二抗孵育1 h后，化學發(fā)光法顯示蛋白條帶，膠片顯影、定影。成像結果采用Quantity One V 4.6軟件分析，測定主帶的灰度值以計算Smad7蛋白表達水平，結果重復3次。

1.8 qRT-PCR法檢測Smad7的表達采用TRIzol法提取各組細胞總RNA。反轉錄成cDNA并進行熒光定量PCR。選用β-actin為內參基因。每個反應設3個復管，反應結束后，熒光定量PCR儀自動分析各管的循環(huán)閾值（threshold cvcle，Ct）。采用2-ΔCt法計算各組組織中目的基因的相對表達量，采用2-ΔΔCt法計算實驗組目的基因表達相對于對照組表達的倍數。各組ΔCt值：Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt＝ΔCt實驗組-ΔCt對照組。引物序列：Smad7上游引物：5′-GAGGATGGAACTTTGGGTCTC-3′，下游引物：5′-TCATTTCCTTGATTAGGGTGGT-3′；β-actin上游引物：5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3′，下游引物：5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3′。

1.9 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，數據均以表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 瞬時轉染miR-21抑制物和模擬物后miR-21表達變化瞬時轉染A549細胞miR-21抑制物和模擬物48 h后，miR-21抑制物組miR-21表達明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F＝28.13，P＜0.05）；miR-21模擬物組miR-21表達明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F＝20.85，P＜0.05）。見圖1。

2.2 瞬時轉染miR-21抑制物和模擬物對Smad7mRNA表達的影響瞬時轉染A549細胞miR-21抑制物和模擬物48 h后，miR-21抑制物組Smad7 mRNA表達明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F＝30.06，P＜0.05）；miR-21模擬物組Smad7 mRNA表達明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F＝29.35，P＜0.05）。見圖2。

2.3 瞬時轉染miR-21抑制物和模擬物對Smad7蛋白表達的影響瞬時轉染A549細胞miR-21抑制物和模擬物48 h后，miR-21抑制物組Smad7蛋白表達明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F＝22.35，P＜0.05）；miR-21模擬物組Smad7蛋白表達明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F＝20.89，P＜0.05）。見圖3。

2.4 MTT實驗結果顯示瞬時轉染A549細胞miR-21抑制物和模擬物48 h后，miR-21抑制物組細胞增殖活性明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F＝18.68，P＜0.05）；miR-21模擬物組細胞增殖活性明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F＝17.54，P＜0.05）。見圖4。

3 討論

研究［6］證實miR具有調節(jié)包括細胞分化、增殖、凋亡或壞死以及發(fā)育等多種生物生命活動過程的作用。研究［7］顯示，多種miR在肺癌組織中存在異常表達，與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關。miR不但可以作為腫瘤的早期診斷指標，還可以作為腫瘤治療的潛在靶點。文獻［8］報道已證實，miR-21在肺癌中高表達，但具體機制尚不十分清楚。

文獻［9］報道，Smad7在耐順鉑肺癌A549細胞株中表達降低。此外，生物信息學提示，Smad7是miR-21潛在作用靶基因［10］。本研究將miR-21模擬物和抑制物轉染A549細胞，通過qRT-PCR法分析顯示，轉染后miR-21模擬物細胞中miR-21的表達明顯增加；轉染后miR-21抑制物細胞中miR-21的表達明顯降低；瞬時轉染A549細胞miR-21抑制物和模擬物后，miR-21抑制物組Smad7 mRNA和蛋白表達明顯高于陰性對照組；miR-21模擬物組Smad7 mRNA和蛋白表達明顯低于陰性對照組。

通過MTT實驗顯示轉染miR-21模擬物的細胞較轉染陰性對照組的細胞A490nm值明顯增加，同時，轉染miR-21抑制物的細胞較轉染陰性對照組的細胞A490nm值明顯降低，提示miR-21模擬物促進A549細胞的增殖，而miR-21抑制物抑制A549細胞的增殖。以上結果提示miR-21抑制物抑制A549細胞的增殖可能是通過促進Smad7表達引起的；而miR-21模擬物促進A549細胞的增殖可能是通過減少Smad7表達引起的。

綜上所述，miR-21通過對肺癌細胞中Smad7表達的靶向調控，進而影響肺癌A549細胞活化增殖，提示miR-21是肺癌A549細胞活化增殖的潛在的靶向分子，可以為干預和預防肺癌提供新思路。

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Influence of miR-21 control Smad7 expression and lung cancer A549 cell line proliferation

Li Bin，Pan Yueyin，Du Yingying
（Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo explore miR-21 regulation of Smad7 in lung cancer A549 cell line as well as its impact on the proliferation of lung cancer A549 cell line.MethodsmiR-21 mimic and inhibitors in lung cancer A549 cell line were transfected by using Lipofectamine 2000 Reagent.After 48 h，Western blot and qRT-PCR were applied to assess the expression of protein and mRNA of Smad7.MTT assay was used to determine the proliferation influence of the transfected lung cancer A549 cell line.ResultsWestern blot and qRT-PCR showed that A549 cell transfected miR-21 mimic exhibited down-regulated Smad7 protein and mRNA expression，and A549 cell transfected miR-21 inhibitor exhibited up-regulated Smad7 protein and mRNA expression.The A549 cell proliferation activity decreased significantly after transfected miR-21 inhibitors.ConclusionmiR-21 inhibitors can increase Smad7 protein and mRNA expression，and suppress the proliferation activity of lung cancer A549 cell significantly.

lung cancer；microRNA-21；Smad7；proliferation

R 73.3

A

1000-1492（2015）12-1766-04

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.026.html

2015-09-08接收

安徽省科技攻關項目（編號：1301042214）；安徽省2012年度科研計劃項目（編號：12070403072）；安徽省高校省級自然科學基金重點項目（編號：KJ2012A157）

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院干部腫瘤科，合肥 230022

李 斌，男，碩士研究生；

潘躍銀，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：yueyinpan＠gmail.com