外源鈣對鹽脅迫下菠菜生理特性的影響

劉麗　曾長立

摘要：設(shè)計不同濃度的CaCl2溶液，在對菠菜（Spinacia oleracea L.）鹽脅迫前采用根部澆灌和葉部噴施的方法進行誘導(dǎo)，鈣誘導(dǎo)5 d后，對菠菜幼苗再進行150 mmol/L NaCl溶液處理，測定其形態(tài)建成和生理生化指標。結(jié)果表明，外源鈣能顯著提高鹽脅迫下菠菜的形態(tài)建成指標；顯著增加可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量；顯著提高SOD和POD活性；顯著降低丙二醛（MDA）和游離脯氨酸含量。當外源鈣離子濃度為30 mmol/L時，其降低鹽脅迫傷害效應(yīng)的效果較好。

關(guān)鍵詞：菠菜（Spinacia oleracea L.）；鹽脅迫；外源鈣；化學(xué)誘抗劑；生理效應(yīng)

中圖分類號：S636.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0118-04

隨著鹽堿地面積的不斷增加和土壤鹽漬化程度的日益加劇，農(nóng)作物的生產(chǎn)受到極大影響，土壤鹽漬化成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素[1]。另外，隨著工業(yè)污染的加劇、海水的盲目開發(fā)利用、化肥的大量投入以及設(shè)施生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，導(dǎo)致了土壤次生鹽漬化加重[2]，土壤鹽漬化已成為設(shè)施栽培中普遍存在的問題。對北京、濟南、上海、江蘇等地大棚土壤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大棚土壤普遍存在著不同程度的次生鹽漬化現(xiàn)象，己嚴重影響了蔬菜作物的生長發(fā)育[3]。鹽脅迫對植物的影響機理可綜合為阻礙植物的生長發(fā)育[4]、造成滲透脅迫[5]、離子失衡[6]、活性氧傷害[7]、營養(yǎng)虧缺[8]和抑制光合作用[9]等。目前，針對鹽害可采取2種措施來進行改良，一是改良土壤；二是進行農(nóng)作物耐鹽育種和栽培，提高農(nóng)作物的耐鹽性。而利用生物措施來治理鹽害被普遍認為是最經(jīng)濟有效的方法[10]?；瘜W(xué)誘抗劑一般是指能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，也稱為抗逆誘導(dǎo)子或抗逆激發(fā)子，具有無毒、無害、無污染的特點，因而采用化學(xué)誘抗劑提高作物耐鹽性是與發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)相適應(yīng)的一項重要綠色生產(chǎn)技術(shù)。Ca2+作為植物必需的一種礦質(zhì)營養(yǎng)元素，在保護植物細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性、穩(wěn)定細胞壁結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)離子運輸和選擇性、控制離子交換行為和細胞壁中酶活性中扮演了關(guān)鍵角色[11]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Ca2+參與鹽脅迫等多種逆境脅迫過程，施加鈣一方面可以緩解因Ca2+不足而引起的礦質(zhì)營養(yǎng)脅迫，另一方面可以增強質(zhì)膜的穩(wěn)定性和鈣信號系統(tǒng)的正常功能，阻止細胞內(nèi)K+的外流和Na+的大量進入，以維持細胞內(nèi)離子平衡，從而提高植物的抗鹽性[12]。

菠菜（Spinacia oleracea L.） 是一種重要的葉菜類蔬菜，營養(yǎng)豐富[13]， 在世界范圍內(nèi)均有較大栽培面積。菠菜為中等耐鹽作物，但是在鹽堿地栽培及次生鹽漬化比較嚴重的大棚栽培生產(chǎn)中，鹽脅迫嚴重影響了其產(chǎn)量與品質(zhì)。有關(guān)外源鈣離子作為化學(xué)誘抗劑能否提高鹽脅迫下菠菜耐鹽性、其運用效果如何等方面的研究還未見報道。因此，本研究設(shè)計了6個不同濃度Ca2+進行誘導(dǎo)，研究了外源鈣離子誘導(dǎo)后對鹽脅迫下菠菜幼苗的形態(tài)建成、生理生化指標的影響，探討了其降低菠菜幼苗鹽害效應(yīng)的生理生化機制，為充分利用鹽堿地種植蔬菜，減輕設(shè)施園藝生產(chǎn)中土壤次生鹽漬化問題，培養(yǎng)健壯幼苗并提高其耐鹽性等方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種苗培養(yǎng)

以日本春秋大葉菠菜為試驗材料，將菠菜種子播于塑料營養(yǎng)缽中，采用基質(zhì)草炭∶蛭石=2∶1（體積比），每立方米加入腐熟膨化雞糞5 kg、三元素復(fù)合肥1.5 kg，用50%多菌靈100 g/m3消毒。待幼苗長到有6片真葉時，移入裝有相同基質(zhì)的塑料盆。

1.2 材料處理

菠菜移栽10 d后，進行根際初始誘導(dǎo)，誘抗劑CaCl2的濃度分別設(shè)為0、10、20、30、40、50 mmol/L，共6個處理，每個處理3次重復(fù)。用根灌法在幼苗根部澆入不同濃度的CaCl2，每株20 mL；初始誘導(dǎo)2 d后葉面噴施進行強化誘導(dǎo)，用手持小噴霧器，均勻噴灑幼苗葉部，以量足但不滴為準。強化誘導(dǎo)3 d后施加鹽脅迫，用根灌法把150 mmol/L NaCl溶液緩慢注入根際基質(zhì)中，每盆40 mL，早晚各脅迫1次。

1.3 指標測定與數(shù)據(jù)分析

鹽脅迫后第5天取樣進行菠菜形態(tài)建成指標和生理生化指標的測定。測定幼苗株高（子葉節(jié)到生長點之間的距離）、莖粗（莖基部）、展開葉片數(shù)、全株鮮重及全株干重，記錄數(shù)據(jù)最后計算出壯苗指數(shù)。

壯苗指數(shù)=莖粗/株高×全株干重

葉綠素含量的測定采用SPAD法測定；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用NBT光化還原法；過氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚比色法測定；可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法；游離脯氨酸活性的測定采用茚三酮法。試驗數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件進行方差分析，并對平均數(shù)采用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Ca2+對NaCl脅迫下菠菜形態(tài)建成指標的影響

由表1可知，不同濃度的Ca2+誘導(dǎo)對鹽脅迫下菠菜生長發(fā)育的影響存在顯著差異。其中，30 mmol/L的Ca2+誘導(dǎo)下菠菜長勢最好，未用Ca2+誘導(dǎo)的菠菜長勢最差。其中株高、展開葉片、干重和壯苗指數(shù)中，30 mmol/L Ca2+處理與其他各濃度處理相比差異均達到顯著水平。表明施用Ca2+濃度為30 mmol/L時，能顯著促進鹽脅迫下菠菜的生長發(fā)育和提高壯苗指數(shù)，有效緩解和減輕菠菜的鹽害效應(yīng)，而較高濃度的Ca2+則顯著降低了壯苗指數(shù)，反而對菠菜幼苗的形態(tài)建成不利。

2.2 外源Ca2+對NaCl脅迫下菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

鹽脅迫下，外源鈣離子對菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響存在差異（圖1）。對于葉綠素含量而言，與對照相比低濃度的外源Ca2+對葉綠素含量影響不顯著，但是當其濃度增加到30 mmol/L時，則可以顯著提高菠菜葉片葉綠素含量；而進一步提高外源Ca2+濃度其作用效果呈明顯下降的趨勢。由此可見，當遭受鹽脅迫時，外施濃度為30 mmol/L Ca2+可使菠菜葉片葉綠素正常合成，從而緩解葉片鹽脅迫下光合作用的降低。對于可溶性蛋白質(zhì)含量來說，低濃度Ca2+誘導(dǎo)后，幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量與對照相比差異未達到顯著水平（圖1），表明外施低濃度的外源鈣離子沒有達到其效果；而較高濃度的Ca2+誘導(dǎo)后，其含量反而比低濃度處理的顯著降低。當外源鈣離子為30 mmol/L時，可以顯著增加菠菜葉片可溶性蛋白質(zhì)的含量。endprint

2.3 外源Ca2+對鹽脅迫下菠菜葉片中MDA和游離脯氨酸含量的影響

與對照相比，使用外源Ca2+誘導(dǎo)后可顯著降低鹽脅迫下菠菜葉片中MDA的累積（圖2）。但不同濃度的Ca2+誘導(dǎo)處理之間差異不顯著，說明不同Ca2+濃度的誘導(dǎo)均能有效降低菠菜葉片中的MDA含量。對于游離脯氨酸而言，10～20 mmol/L的外源Ca2+誘導(dǎo)下其處理之間差異未達到顯著水平，但是當外源Ca2+誘導(dǎo)濃度提高到30 mmol/L-1時，則可顯著增加菠菜葉片中游離脯氨酸的含量；而進一步增加Ca2+誘導(dǎo)濃度，其作用效果則明顯下降（圖2）。

2.4 外源Ca2+對鹽脅迫下菠菜葉片中SOD和POD活性的影響

外源Ca2+對鹽脅迫下菠菜葉片中SOD和POD活性的影響見圖3。從圖3可知，隨著外源Ca2+誘導(dǎo)濃度的增加，菠菜葉片中SOD和POD活性呈先升高后降低的趨勢。使用一定濃度范圍內(nèi)的外源Ca2+誘導(dǎo)可顯著增加SOD和POD活性。對于SOD，10 mmol/L的Ca2+誘導(dǎo)濃度與對照相比能顯著提高菠菜葉片SOD活性， 但與20 mmol/L Ca2+誘導(dǎo)濃度處理間差異不顯著。而20～40 mmol/L Ca2+誘導(dǎo)濃度處理間差異也未達到顯著水平。當Ca2+濃度增加到50 mmol/L時，反而使SOD活性顯著降低。當Ca2+濃度為30 mmol/L時，菠菜葉片POD活性達到最高值，與其他處理間差異顯著。

3 討論

鹽脅迫是影響作物生長和降低作物產(chǎn)量的主要障礙因子之一。從形態(tài)建成指標來看，鹽分對非鹽生植物的脅迫效應(yīng)就是阻止其生長[14]。在本試驗中，NaCl脅迫使菠菜的生長受到嚴重抑制，而通過使用外源Ca2+進行誘導(dǎo)后可顯著緩解這種抑制作用，且能顯著增加干物質(zhì)的積累和提高壯苗指數(shù)，增強植株的耐鹽性。但過高濃度的Ca2+進行誘導(dǎo)后其作用效果反而顯著下降，可能是CaCl2也作為一種鹽分，增加了土壤根際中的Cl-，抑制根系對NO3ˉ等陰離子養(yǎng)分的吸收[15]。

研究表明，各種細胞器中受鹽分影響比較敏感的是葉綠素[16]。鹽脅迫條件下，NaCl能增強葉綠素酶的活性， 加速葉綠素分解。本研究中，使用30 mmol/L以上外源Ca2+后可顯著提高菠菜葉綠素含量，這與在蕓薹屬植物上的研究結(jié)果一致[17]。CaCl2能提高葉綠素含量，其可能的機理是CaCl2能提高抗氧化酶活性，清除活性氧，有效延緩葉綠素含量的下降，增強菠菜對鹽脅迫的適應(yīng)，提高葉片捕捉和利用光能的能力。此外，外源鈣能提高菠菜葉片中的可溶性蛋白質(zhì)含量，這與劉雪琴等[18]在玉米上的研究結(jié)果一致。

鹽脅迫下MDA含量的增加可能是活性氧（ROS）所導(dǎo)致的氧化脅迫對細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞[19]，而外源Ca2+減少或阻止鹽脅迫下Na+對Ca2+的替換，從而提高了膜的流動性、減少了活性氧的產(chǎn)生[20]以及抑制了膜脂的過氧化，以維持細胞膜正常的結(jié)構(gòu)，保證植物體各種代謝循環(huán)的正常進行。另外，游離脯氨酸作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境條件下大量累積[21]，待逆境解除后主要用來參與葉綠素的合成，隨著逆境的緩解很快減少。本研究中采用外源Ca2+進行誘導(dǎo)后，可以顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，與陳淑芳等[22]在黃瓜上的結(jié)論一致。脯氨酸的積累一方面可以增加細胞的滲透調(diào)節(jié)能力，另一方面又可以避免細胞氨中毒。鹽脅迫下外源Ca2+能顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，是否是因為其參與了脯氨酸積累的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用還值得深入研究。

對于POD來說，其影響趨勢與SOD相似，但是Ca2+誘導(dǎo)濃度為40 mmol/L時，POD活性就明顯降低。植物在遭受逆境脅迫時會引起氧化脅迫的產(chǎn)生[23]，導(dǎo)致生成活性氧（ROS）而破壞植物組織及細胞。植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，如SOD、POD等可有效減少這些活性氧的破壞作用。而采用外源Ca2+能顯著提高鹽脅迫下菠菜幼苗葉片中的SOD與POD活性，這與其他研究結(jié)果一致[24]。因此，外源Ca2+通過提高菠菜幼苗葉片中這些保護酶的活性，增強了清除活性氧的能力，從而減少其對膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞。

4 小結(jié)

采用外源Ca2+誘導(dǎo)后可顯著促進鹽脅迫下菠菜的生長，減輕鹽害，增加植株干重及鮮重，顯著增加壯苗指數(shù)，顯著提高葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)與游離脯氨酸含量，提高細胞保護酶SOD和POD活性，顯著降低菠菜葉片中MDA含量，減輕鹽脅迫對葉片膜脂過氧化的程度。其中，30 mmol/L的CaCl2誘導(dǎo)處理在提高菠菜抗鹽性上效果較好。

參考文獻：

[1] ASLAM M， QURESHI R H， AHMED N. A rapid screening technique for salt tolerance in rice （Oryza Sativa L.）[J]. Plant and Soil， 1993， 150（1）： 99-107.

[2] 張士良，薛連秋，郭 鵬，等.保護地土壤次生鹽漬化成因及防控措施[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2008（3）：5-16.

[3] 夏立忠，楊林章，王德建.蘇南設(shè)施栽培中旱作人為土養(yǎng)分與鹽分狀況的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（6）：43-46.

[4] TAKEMURA T，HANAGATA N， SUGIHARA K， et al. Physiological and biochemical responses to salt stress in the mangrove， Bruguiera gymnorrhiza[J]. Aquatic Botany， 2000， 68： 5-28.

[5] MUNNS R， TESTER M. Mechanisms of salinity tolerance[J]. Annual Review of Plant Biology， 2008，59：651-681.endprint

[6] SOMERVILLE C R， MEYEROWITZ E M. The Arabidopsis Book[M]. Rockville MD： American Society of Plant Biologists， 2002.

[7] MILLER G， SUZUKI N， RIZHSKY L. et al. Double mutants deficient in cytosolic and thylakoid ascorbate peroxidase reveal a complex mode of interaction between reactive oxygen species， plant development， and response to abiotic stresses[J]. Plant Physiology， 2007， 144（4）： 1777-1785.

[8] PARIDA A， DAS A B， DAS P. NaCl stress causes changes in photosynthetic pigments， proteins and other metabolic components in the leaves of a true mangrove， Bruguiera parviflora， in hydroponic cultures[J]. Plant Biology，2002，45（1）：28-36.

[9] SOUSSI M， OCANA A， LIUCH C. Effects of salt stress on growth， photosynthesis and nitrogen fixation in chickpea （Cicer arietinum L.）[J]. Journal of Experimental Botany， 1998， 49： 329-337.

[10] ASHRAF M， MCNEILLY T， BRADSHAW A D. Selection and heritability of tolerance to sodium chloride in four forage species [J]. Crop Science，1987，27：232-234.

[11] RENGEL Z. The role of calcium in salt toxicity[J]. Plant Cell Environment，1992，15：625-632.

[12] CRAMER G R，L？魧UCHLI A，POLITO V S. Displacement of Ca2+ by Na+ form the plasmalemma of root cells[J]. Plant Physiology，1985，79：207-211.

[13] 劉 嬌.菜中之王——菠菜[J].解放軍健康，2003（5）：29.

[14] 王玉鳳，王慶祥，商麗威.鈣對NaCl脅迫下玉米幼苗保護酶活性等生理特性的影響[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2008（26）：119-123.

[15] 陸景陵.植物營養(yǎng)學(xué)[M]. 第二版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 2003.

[16] MURILLO-AMADOR B， JONES H G， KAYA C. et al. Effects of foliar application of calcium nitrate on growth and physiological attributes of cowpea（Vigna unguiculata L. Walp） grown under salt stress[J]. Environmental and Experimental Botany，2006，58（1-3）：188-196.

[17] 曾長立，董元火.外源鈣對鹽脅迫下蕓薹屬植物幼苗的生理效應(yīng)[J].中國油料作物學(xué)報，2008，30（4）：433-437.

[18] 劉雪琴，仝瑞建，施佳妮.外源Ca2+對鹽脅迫下玉米萌發(fā)與幼苗生長的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（17）：197-200.

[19] ZHANG C F， HU J， LOU J，et al.Sand priming in relation to physiological changes in seed germination and seedling growth of waxy maize under high salt stress[J]. Seed Science and Technology，2007，35（3）：733-738.

[20] 晏 斌，戴秋杰，劉曉忠，等.鈣提高水稻耐鹽性的研究[J]. 作物學(xué)報，1995，21（6）：685-690.

[21] L？魷PEZ-CARR？魷IN A I，CASTELLANO R，ROSALES M A， et al. Role of nitric oxide under saline stress：Implications on proline metabolism[J]. Biology Planarum，2008，52（3）：587-591.

[22] 陳淑芬，郭 軍.鈣誘導(dǎo)黃瓜幼苗耐鹽性效應(yīng)[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（11）：346-349.

[23] SAIRAM R K， SAXENA D C. Oxidative stress and antioxidants in wheat genotypes： Possible mechanism of water stress tolerance[J]. Journal of Agronomy and Crop Science， 2002， 184（1）： 55-61.

[24] 丁能飛，傅慶林，劉 琛，等.外源氯化鈣對鹽脅迫下西蘭花抗氧化酶系統(tǒng)及離子吸收的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（6）： 133-137.endprint