肌肉中硝基呋喃類代謝物測(cè)定方法優(yōu)化

龔波

摘要：比較了肌肉中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測(cè)的常用方法，并加以改進(jìn)。

關(guān)鍵詞：肌肉；硝基呋喃類代謝物；檢測(cè)方法；比較

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2014）12-0007-01

硝基呋喃類藥物是一類人工合成的具有5-硝基結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽性及陰性菌均有一定抗菌作用。因其價(jià)格低廉，效果好，被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖中[1]。研究表明，此類藥物及其代謝物可使試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生癌變和基因突變，我國已于2002 年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令[2]。硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝速度快，不易被檢測(cè)到[3]，然而其代謝產(chǎn)物可在相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)留存于可食組織中，因此常通過監(jiān)測(cè)其代謝物的殘留來監(jiān)控硝基呋喃類物的使用情況。

1 常用方法

目前，在肌肉中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測(cè)中，常用的方法有農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-4-2006動(dòng)物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]（以下簡稱《公告》）。該標(biāo)準(zhǔn)采用依次用甲醇、乙醇和乙醚洗滌，去除雜質(zhì)。在酸性條件下水解，與2-硝基苯甲醛溶液衍生化反應(yīng)，調(diào)PH值后產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯提取，氮?dú)獯蹈?。溶解殘余物，用LC-MS測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

另一種方法是GB/T 21311-2007動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]（以下簡稱《國標(biāo)》）。該標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)鹽酸水解，鄰硝基苯甲醛衍生化反應(yīng)，調(diào)PH值后，產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯提取，正己烷凈化，氮?dú)獯蹈?。溶解殘余物，用LC-MS測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

2 方法比較

2.1 洗滌

《公告》中樣品用甲醇、乙醇和乙醚洗滌6次，步驟繁瑣，且經(jīng)乙醚洗滌后，造成后面步驟中離心管易膨蓋，提取液灑出，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

《國標(biāo)》中，樣品經(jīng)過10mL甲醇-水溶液（1+1）洗滌1次后，可直接酸水解衍生，步驟簡單，易操作。

2.2 衍生

雖然2種方法中加入鹽酸的濃度和衍生劑的溶劑均不同，但經(jīng)試驗(yàn)比較，兩者對(duì)試驗(yàn)結(jié)果并沒有十分顯著的影響，均具有可操作性。

2.3 提取

《公告》方法中的樣品經(jīng)提取吹干后得到清亮的復(fù)溶液，經(jīng)濾膜過濾后即可上機(jī)。而《國標(biāo)》方法中的樣品提取吹干后復(fù)溶液渾濁，即使按照方法中用乙腈飽和的正己烷去脂2次后，溶液任然較渾濁，不易通過濾膜，上機(jī)后對(duì)儀器有一定損傷。

2.4 流動(dòng)相的選擇

比較兩種方法梯度洗脫程序，見表1，表2?！豆妗贩椒鲃?dòng)相配置復(fù)雜，

且峰型不如《國標(biāo)》的好，但兩種程序耗時(shí)都較長。筆者以XbridgeC182.1*150mm， 3.5μm為例比較了乙腈- 乙酸銨、甲醇- 乙酸銨兩種不同流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物離子化程度的影響。結(jié)果表明，乙腈-0.5 mmol /L 乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)，四種代謝物的衍生物響應(yīng)較為穩(wěn)定[6]。在水相中不加入0.1%甲酸，也能得到較好的質(zhì)譜離子化效率。因此，筆者優(yōu)化了梯度洗脫程序，方案見表3。

3 小結(jié)

經(jīng)過比較，《國標(biāo)》方法雖然洗滌步驟比較簡單，但提取后油脂太多，難以得到清亮的待測(cè)液，對(duì)儀器有一定損傷，故建議按照《公告》的方法進(jìn)行前處理。但《公告》方法的流動(dòng)相及洗脫程序繁瑣耗時(shí)，建議按照筆者改進(jìn)的流動(dòng)相及洗脫程序進(jìn)行上機(jī)分析。這樣，既可以保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性，也可以提高工作效率。