藥用真菌雙向固體發(fā)酵草烏后菌質(zhì)對(duì)小鼠的急性毒性及致大鼠心律失常作用

王身艷，劉學(xué)湘，王娟紅，陳建偉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023)

草烏為毛茛科植物北烏頭(Aconitum kusnezoffii Reichb．)的干燥母根。草烏是臨床應(yīng)用較多的草藥之一，主要用于風(fēng)寒濕痹、周身關(guān)節(jié)疼痛屬于寒濕偏勝者。但是，由于其毒性大，中毒反應(yīng)快，在臨床應(yīng)用上受到限制。草烏中毒主要作用于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，對(duì)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的毒性最為嚴(yán)重，對(duì)心臟的毒性最為明顯，對(duì)其中毒機(jī)理研究報(bào)道較多。①直接對(duì)心臟的毒性作用，引起嚴(yán)重的心律失常，其心律失常的特點(diǎn)是多樣易變，以頻發(fā)室性早搏最常見，且為多源性，并容易形成二聯(lián)律及陣發(fā)性室速、扭轉(zhuǎn)型室速，甚至發(fā)展為室顫，導(dǎo)致猝死。②興奮心臟迷走神經(jīng)，降低竇房結(jié)的自律性和房室結(jié)的傳導(dǎo)性，引起竇性心動(dòng)過緩和房室傳導(dǎo)阻滯。③對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)先興奮后麻痹，局部皮膚粘嗅的感覺神經(jīng)末梢先興奮，有搔癢和燒灼感，繼以麻痹、知覺喪失［1］。

近年來，服用草烏引起的中毒事件仍然時(shí)有發(fā)生。將藥用真菌接種于草烏基質(zhì)上，在一定條件下經(jīng)固體發(fā)酵獲得菌質(zhì)。已有研究表明部分菌質(zhì)具有保持或增強(qiáng)鎮(zhèn)痛抗炎的作用［2－3］。筆者采用藥用真菌雙向固體發(fā)酵技術(shù)制備菌質(zhì)，并對(duì)菌質(zhì)的急性毒性及對(duì)大鼠心律失常的影響進(jìn)行分析，以期為草烏的解毒提供新方法。

1 材料與方法

1．1 藥物 草烏購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物北烏頭(Aconitum kusnezoffii Reichb．)的干燥母根;靈芝(Ganoderma lucidum(wolfLeyss．)Karst)、茯苓菌(Poria cocos(Schw．)Wolf)、扇菇(Panellusstypticus(Bull．ex Fr．)Karst．)、紅栓菌［Trametes cinnabarina(Jacq．)Fr．］，均由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所保藏。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(滬)2007－005;SD大鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)為SCXK(滬)2007－0005，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 SPF級(jí)動(dòng)物房。

1．3 主要儀器與試劑

1．3．1 主要儀器。AE240分析天平(METTLER公司);MP12001電子天平(上海市橫平科學(xué)儀器有限公司);DK-8B型電熱恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);PowerLab/8s生理記錄儀，為澳大利亞AD Instrument公司產(chǎn)品。

1．3．2 試劑。CMC-Na(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙醚(南京化學(xué)試劑有限公司)。

1．4 方法

1．4．1 試驗(yàn)藥物的制備。

1．4．1．1 菌質(zhì)的制備。在一定的生物技術(shù)控制下，運(yùn)用“固體雙向發(fā)酵”技術(shù)，分別用靈芝、茯苓、紅栓及扇菇菌發(fā)酵草烏，于25～28℃隔水式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 d后取出，60℃條件下恒溫干燥，粉碎后過120目篩，備用。

1．4．1．2 草烏炮制品的制備。按照文獻(xiàn)［4］中的新法1炮制，取出，60℃條件下恒溫干燥，粉碎后過120目篩，備用。

1．4．1．3 藥物配制。將菌質(zhì)及草烏炮制品混懸于0．1%的CMC-Na水溶液中，正常對(duì)照組給等體積的0．1%的CMCNa水溶液中，臨用現(xiàn)配。

1．4．2 最大耐受量試驗(yàn)。

1．4．2．1 預(yù)試驗(yàn)。先用 10．0 g/kg 和 2．5 g/kg 劑量分別灌胃，0．02 ml/g每試驗(yàn)組4只小鼠，雌雄各半，試驗(yàn)前禁食12 h，不禁水，無1例死亡，將劑量遞增為0．025 ml/g，再試驗(yàn)4只小鼠，無1例死亡。當(dāng)劑量遞增至0．04 ml/g時(shí)(最大劑量，剛好能用灌胃針頭注射，相當(dāng)于原藥材16 g/kg)，無1例死亡。

1．4．2．2 最大耐受量試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，最大無毒性反應(yīng)劑量做最大耐受量試驗(yàn)。取小鼠60只，雌雄各半，體重(20±2)g，灌胃給藥。按預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分為炮制品組、正常對(duì)照組、栓烏菌質(zhì)組、靈烏菌質(zhì)組、扇烏菌質(zhì)組、茯?yàn)蹙|(zhì)組，每組雌雄各半，每組10只，以最大給藥濃度0．32 g/ml，最大給藥量0．04 ml/g，給藥1次，然后觀察給藥后所有小鼠呼吸，活動(dòng)(顫抖、跌倒)、眼、瞳孔大小以及飲食、排泄物、皮毛、分泌物，尤其是觀察給藥后5 h內(nèi)動(dòng)物的反應(yīng)情況。然后，每天上下午各觀察1次，記錄中毒癥狀及中毒反應(yīng)起始時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間及記錄給藥前、給藥后第7天和第14天的體重。給藥后各給藥組動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，表現(xiàn)為灌胃15 min后，動(dòng)物均開始出現(xiàn)不同程度的聳毛及食欲不振的現(xiàn)象，茯?yàn)蹙|(zhì)組及炮制品組還出現(xiàn)流口水、瞇眼或眼睛分泌物增多的現(xiàn)象等中毒癥狀。試驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠并解剖，未出現(xiàn)肉眼可見的器官顏色及質(zhì)地改變的現(xiàn)象。由表1可知，相同劑量下灌胃給藥，在給藥7 d后各處理組體重增長(zhǎng)明顯低于正常對(duì)照組;給藥14 d后靈烏菌質(zhì)組體重增長(zhǎng)很快，接近于正常對(duì)照組。

1．4．2．3 心律失常試驗(yàn)。取健康成年SD大鼠，體重180～220 g，雌雄各半，于正式試驗(yàn)前將大鼠用乙醚麻醉，在Power-Lab/8s生理記錄儀上記錄H導(dǎo)心電圖，無先天心律失常大鼠符合試驗(yàn)要求。選取合格大鼠48只，隨機(jī)分成6組，每組8只，雌雄各半，分別為正常對(duì)照組、炮制品組(按生藥計(jì)12 g/kg)、茯?yàn)蹙|(zhì)組(按生藥計(jì)12 g/kg)、靈烏菌質(zhì)組(按生藥計(jì)12 g/kg)、扇烏菌質(zhì)組(按生藥計(jì)12 g/kg)和栓烏菌質(zhì)組(按生藥計(jì)12 g/kg)。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，腹腔注射20%烏拉坦1．59 g/kg麻醉，仰位固定，先用在PowerLab/8s生理記錄儀試驗(yàn)系統(tǒng)記錄一段正常H導(dǎo)心電圖，動(dòng)物心電穩(wěn)定后，分別記錄心律失常的發(fā)生次數(shù)。

按照以下公式計(jì)算心律失常發(fā)生率。心律失常發(fā)生率(%)=每分鐘心律失常發(fā)生次數(shù)/心率×100%。

1．4．3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。試驗(yàn)結(jié)果均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(ˉx±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，心率失常發(fā)生率的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果 給藥后各給藥組動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，表現(xiàn)為灌胃15 min后動(dòng)物均開始出現(xiàn)不同程度的聳毛及食欲不振的現(xiàn)象，茯?yàn)蹙|(zhì)組及炮制品組還出現(xiàn)流口水、瞇眼或眼睛分泌物增多的現(xiàn)象等中毒癥狀。試驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，解剖后未出現(xiàn)肉眼可見的器官顏色及質(zhì)地改變的現(xiàn)象。由表2可知，相同劑量下灌胃給藥，在給藥7 d后各處理組體重增長(zhǎng)明顯低于正常對(duì)照組;給藥14 d后靈烏菌質(zhì)組體重增長(zhǎng)很快，接近于正常對(duì)照組。

表1 最大耐受量

表2 最大耐受量體重的變化(n=10) ˉx±SD

2．2 各菌質(zhì)對(duì)大鼠心律失常作用 從圖1和表3可以看出，與炮制品組相比，各發(fā)酵組對(duì)大鼠心律失常發(fā)生次數(shù)及發(fā)生率有顯著降低作用(P＜0．05或P＜0．01)，各發(fā)酵組心律失常發(fā)生次數(shù)之間沒有顯著差異。

表3 各菌質(zhì)對(duì)大鼠心臟毒性的影響(ˉx±SD，n=8)

3 討論

在急性毒性預(yù)試驗(yàn)中對(duì)草烏生品也進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在按2．5 g/kg給藥劑量時(shí)生品組的小鼠全部死亡，表明草烏生品毒性很大，使用前必須解毒。筆者比較了傳統(tǒng)炮制法和雙向固體發(fā)酵法的解毒效果，結(jié)果表明雙向固體發(fā)酵組對(duì)致大鼠心律失常的發(fā)生次數(shù)與傳統(tǒng)炮制品組有顯著差異，能明顯減少大鼠心律失常的發(fā)生次數(shù)，降低心律失常發(fā)生率，說明發(fā)酵解毒效果比炮制解毒效果更好。

藥用真菌發(fā)酵中藥自古有之，如神曲、半夏曲等中藥是以自然界的單一或混合的微生物在自然條件下發(fā)酵而成，發(fā)酵菌種大多為空氣中霉菌、細(xì)菌等微生物。雙向性固體發(fā)酵是用藥用真菌與具有一定治療作用的藥材在特定的條件下共同培養(yǎng)而獲取菌質(zhì)的一種方法，其實(shí)質(zhì)是藥用真菌中的酶對(duì)中藥中的化學(xué)成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生具有不同生物活性的化學(xué)物質(zhì)。研究表明，雙向固體發(fā)酵后的菌質(zhì)具有降低中藥的毒性或提高中藥藥效等作用［5－6］。

藥用真菌發(fā)酵草烏所得菌質(zhì)具有減毒和增效［2－3］的作用，對(duì)菌質(zhì)化學(xué)成分分析、探討發(fā)酵的轉(zhuǎn)化機(jī)制以及研究在發(fā)酵過程中發(fā)揮作用的酶，還有待進(jìn)一步研究。

［1］林釗華．草烏中毒致惡性心律失常5例的救治體會(huì)［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010，26(20):3132．

［2］王身艷，余黎，劉學(xué)湘，等．靈芝雙向固體發(fā)酵草烏后菌質(zhì)抗炎鎮(zhèn)痛作用研究［J］．中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2012，7(5):352 －356．

［3］王身艷，余黎，蔣亞平，等．雙向發(fā)酵對(duì)草烏中烏頭堿類成分含量影響及菌質(zhì)抗炎鎮(zhèn)痛作用的初步研究［J］．中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2011，6(4):246－250．

［4］陳龍，蔡寶昌，馬聘，等．草烏幾種炮制品的鎮(zhèn)痛作用比較［J］．中國中藥雜志，1995，20(1):22 －26，61．

［5］王身艷，潘揚(yáng)，蔣亞平，等．雙向發(fā)酵對(duì)川烏指紋圖譜及烏頭堿類成分含量的影響［J］．中國藥房，2010，21(39):3712 －3714．

［6］劉學(xué)湘，潘揚(yáng)，蔣亞平，等．青木香發(fā)酵后總馬兜鈴酸和馬兜鈴酸Ⅰ的含量測(cè)定［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29(2):202 －204．