伊犁河谷地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的流行病學(xué)調(diào)查

夏春芳，高 亮，王傳鋒，馬玉輝

(1．伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧835000;2．伊犁州昭蘇縣畜牧獸醫(yī)局，新疆昭蘇835600)

豬繁殖與呼吸綜合征又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為主要特征的急性接觸性傳染?。?-2］。該病于1987年在美國首次被證實后迅速蔓延至許多國家和地區(qū)［3］。1996年，郭寶清等［4］首次從國內(nèi)疑似PRRSV感染豬群中分離出PRRSV，我國存在該病得以證實。2006年，該病在我國中南部地區(qū)暴發(fā)后迅速傳遍全國主要區(qū)域，并引起持續(xù)性感染及繼發(fā)其他病原體的感染，很難得以凈化，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失［5-6］。

PRRSV屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬，為一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒［7］。在結(jié)合臨床癥狀和病理解剖的基礎(chǔ)上，筆者應(yīng)用RT-PCR檢測技術(shù)對伊犁河谷地區(qū)主要規(guī)?；B(yǎng)豬場展開流行病學(xué)調(diào)查，了解該地區(qū)豬群中PRRS的流行態(tài)勢和現(xiàn)狀，以期為研究和制定有效的綜合防控措施提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病料。315份組織病料分別于2014年5月至2015年7月取自伊寧市和伊寧縣、察縣、霍城縣、新源縣、尼勒克縣13個規(guī)模化養(yǎng)豬場發(fā)病自然死亡的豬。每次采樣均由隨機采樣，每份樣品包括肺臟、脾臟、淋巴結(jié)。標記取樣時間、地點及取樣部位，-20℃下保存?zhèn)溆?，病料采集情況見表1。陽性對照毒株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實驗室保存并提供，為PRRSV ATCC VR-2332株。

1．1．2 酶和試劑。瓊脂糖和DL2000 DNA Marker，均購自生工生物工程(上海)有限公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTPs、TaqDNA聚合酶、總RNA抽提試劑 RNAiso Reagent，均購自TaKaRa公司;氯仿和無水乙醇為國產(chǎn)分析純級。

1．1．3 引物。利用 Premier 5．0和 Oligo 6．0分子生物學(xué)軟件，按照引物設(shè)計原則，以GenBank數(shù)據(jù)庫中保守PRRSV基因序列ORF7基因序列為參照，設(shè)計了1對特異性引物，引物序列為 P1:5′-ATATGCCAAATAACAACG-3′;P2:5′-AAGAATGCCAGCCCATCATG-3′，由TaKaRa公司合成，預(yù)期擴增產(chǎn)物為372 bp。

1．1．4 儀器。小型高速冷凍離心機(Beckman Allegra 64)、PCR 儀(TC-5000，Bibby Scientific Ltd．)、電泳儀(DYY-Ⅲ8B，北京六一儀器廠)、凝膠成像、分析系統(tǒng)(英國UVP公司)等。

1．2 方法 此次調(diào)查包括發(fā)病豬群相關(guān)數(shù)據(jù)的收集和實驗室檢測2個部分，資料收集主要在養(yǎng)殖場內(nèi)與病料采集同時進行;實驗室檢測在伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)系疫病監(jiān)測實驗室內(nèi)完成，隨病料的采集陸續(xù)進行，于2015年7月底結(jié)束。

1．2．1 發(fā)病豬群相關(guān)數(shù)據(jù)的收集。與病料采集同時進行，記錄發(fā)病豬群的臨床癥狀和病死豬的病理解剖特征。此外，還要詳細記錄每個豬場發(fā)病豬群其他相關(guān)的資料，如豬場的規(guī)模、豬只來源及流動情況;豬群的發(fā)病既往史;豬群PRRSV免疫情況;生產(chǎn)母豬的流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)弱仔、死胎、木乃伊胎以及發(fā)情期等;仔豬的發(fā)病日齡、發(fā)病率、死亡率、發(fā)病持續(xù)時間等。

1．2．2 病毒總RNA的提取。量取500 mg樣品放入研缽中研磨，加入適量的RNAiso Reagent至將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，室溫靜置至樣品完全融化，繼續(xù)研磨至透明狀。然后，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5 min。12 000 g 4℃下離心5 min。吸取上清液，移至新的離心管中。加入適量氯仿至勻漿裂解液中，離心管蓋緊，用力振蕩。充分乳化溶液至呈現(xiàn)乳白狀后室溫靜置5 min，然后12 000 g4℃離心15 min，再吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個離心管中。加入等體積的異丙醇至上清液中，而后上下顛倒使其充分混勻，15～30℃下靜置10 min后12 000 g4℃再次離心10 min。此時試管底部一般會出現(xiàn)沉淀，小心棄去上清液，沿離心管壁緩慢地加入1 ml75%的乙醇，輕輕上下顛倒離心管，洗滌管壁。12 000 g 4℃再次離心5 min，小心棄去乙醇。室溫干燥沉淀2～5 min，最后加入適量的RNase-free水溶解沉淀，至RNA沉淀完全溶解后置于-80℃條件下保存。

1．2．3 RT-PCR。反轉(zhuǎn)錄(RT)體系:1 μl試驗樣品 RNA(≤500 ng Total RNA)、2 μl MgCl2(25 mmol/L)、1 μl dNTP Mixture(各 10 mmol/L)、1 μl RT Buffer(10 × )、0．5 μl P2(50 pmol/L)、0．25 μl RNase Inhibitor(40 U/μl)、0．5 μl AMV Reverse Transcriptase(5 U/μl)、3．75 μl RNase Freed H2O。擴增條件如下:50℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)20 min;99℃變性5 min;5℃冷卻5 min，1個循環(huán)。

PCR反應(yīng)體系為:反應(yīng)體系為50μl，包括10μl模板cDNA、10 μl PCRBuffer(5 ×)、28．75 μl dH2O、0．25 μl Ex Taq酶(5 U/μl)、0．5 μl P1(25 pmol/L)、0．5 μl P2(25 pmol/L)。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:94℃變性2 min;94℃變性1 min;55℃退火30 s;72℃延伸1 min，共進行30個循環(huán);最后72℃再延伸10 min。結(jié)束后將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果與分析

2．1 RT-PCR擴增結(jié)果 從圖1可以看出，從病豬肺臟、脾臟、淋巴結(jié)病料及陽性對照株中均擴增出長度為372 bp的特異性目的條帶，譜帶清晰，與預(yù)期結(jié)果相一致，而陰性對照未擴增到此特異性條帶。這說明被檢豬病料中含有PRRSV的特異性靶序列，已被PRRSV所感染。

2．2 不同地區(qū)樣品的PRRSV陽性率 此次調(diào)查采樣共315份，PRRSV檢測結(jié)果為陽性的樣品207份，陽性率達65．7%，陽性樣品豬的臨床癥狀及病理解剖基本符合PRRSV感染特征。207份陽性樣品分別來自伊寧市、察縣、伊寧縣、霍城縣、尼勒克縣、新源縣的13個養(yǎng)殖場。其中，人口及養(yǎng)殖場較為密集的伊寧市、察縣和伊寧縣的陽性率分別為85．3%、75．9%和69．4%，顯著高于新源縣和尼勒克縣。各縣(市)陽性樣品數(shù)及陽性率見表1。

表1 伊犁河谷地區(qū)PRRS病料的陽性率

2．3 不同月齡樣品的PRRSV陽性率 由表2可知，不同月齡豬群均有PRRSV陽性樣品。1月齡、2月齡、3月齡及大于3 月齡的小組陽性率分別為 60．0%、79．3%、60．5% 和39．1%，總陽性率分別為 17．1%、29．2%、16．5% 和 2．86%。其中，2月齡仔豬的陽性率最高，大于3月齡豬的陽性率最低，與其他組差異顯著;小于1月齡及3月齡豬的陽性率相近，差異不顯著。

表2 不同月齡樣品的PRRSV陽性率

2．4 不同季節(jié)樣品的PRRSV陽性率 由表3可知，不同季節(jié)采集的病豬樣品各小組陽性率分別為68．1%、64．1%、63．8%和68．3%，其中春季和冬季的陽性率略高于夏季和秋季，但差異不顯著。

表3 不同季節(jié)樣品的PRRSV陽性率

3 討論

3．1 將RT-PCR檢測技術(shù)用于PRRSV診斷的優(yōu)越性 鑒于臨床中PRRS病例大多為混合感染或繼發(fā)感染，PRRS診斷難度增大，必須將臨床癥狀、病理變化、血清學(xué)診斷及分子學(xué)診斷等結(jié)合起來。臨床癥狀和病理變化只能進行初步診斷，若要進一步確診必須依靠實驗室診斷技術(shù)。此次調(diào)查結(jié)果表明，通過臨床檢查及病理變化的疑似病例的病料中大多能擴增出大小372 bp的特異性條帶，證實RT-PCR檢測技術(shù)具有快速、簡便、特異性強等優(yōu)點，是檢測PRRSV的好方法。

3．2 伊犁河谷地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的流行情況 伊犁河谷地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場普遍存在PRRSV感染情況，已對該地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成嚴重威脅，與國內(nèi)其他省份的調(diào)查報道結(jié)果相似，應(yīng)引起高度重視。伊寧市、察縣、伊寧縣PRRSV的陽性率分別為85．3%、75．9%和69．4%，顯著高于新源縣和尼勒克縣。究其原因，主要包括以下方面:①伊寧市、察縣、伊寧縣養(yǎng)豬場相對較為密集，尤其是小型養(yǎng)殖戶較多，這些小型養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖規(guī)模小、密度大、豬舍簡陋、衛(wèi)生差、污染嚴重、防疫觀念淡薄;②人員來往、豬只流通較為頻繁和盲目引種，而相當(dāng)一部分小型養(yǎng)殖場難以建立完善的防疫隔離屏障，給該病的傳播創(chuàng)造了有利條件。

此次調(diào)查中不同月齡的豬只感染發(fā)病率存在明顯差異。采樣的315頭病死豬中，1～2月齡仔豬陽性率較高，而大于3月齡豬陽性率相對較低，這表明1～2月齡的仔豬的發(fā)病率最高，也是PRRSV主要的貯存宿主。該試驗中不同季節(jié)豬群感染PRRSV并發(fā)病差異不明顯，這與路憲禮等［8］和李和平等［9］報道結(jié)果不一致。這可能與豬群隱性帶毒、發(fā)病豬群的持續(xù)性感染、PRRSV的變異和混合感染等因素有關(guān)，還有待進一步研究。

［1］CHO J G，DEE SA．Porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］．Theriogenology，2006，66(3):655-622．

［2］楊漢春．豬繁殖與呼吸綜合征綜述［J］．豬業(yè)科學(xué)，2006(5):19-20．

［3］KEFFABER K．Reproductive failure of unknown etiology［J］．Am Assoc Swine Pract Newsl，1989，2:1-10．

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［5］童光志，周艷君，郝曉芳，等．高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的分離鑒定及分子流行病學(xué)分析［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2007，29(5):323-326．

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［7］陳溥言．家畜傳染病學(xué)［M］．5版．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2006:221-223．

［8］路憲禮，周碧君，羅險峰，等．貴州省豬繁殖與呼吸綜合征流行病學(xué)調(diào)查［J］．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(5):133-136．

［9］李和平，吳發(fā)興，李曉成，等．河南省豬繁殖與呼吸綜合征流行病學(xué)調(diào)查［J］．畜牧獸醫(yī)科學(xué)，2007，23(4):19-21．