藥用植物青陽參可培養(yǎng)內(nèi)生菌分離與多樣性分析

路則寶

(楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，云南楚雄675005)

內(nèi)生菌可生活在各種植物的根、葉、莖、花與果實(shí)內(nèi)，主要包括細(xì)菌、真菌、放線菌，其類群十分豐富，能夠產(chǎn)生很多新的活性物質(zhì)，因此植物內(nèi)生菌已成為國內(nèi)外生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。內(nèi)生菌對于宿主植物主要有益的作用有調(diào)節(jié)生長、抗蟲害、抗逆性及促進(jìn)植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的合成等。內(nèi)生菌可以通過促進(jìn)中藥有效成分的生成或積累影響道地藥材的形成與品質(zhì)。隨著植物內(nèi)生菌研究的不斷深入發(fā)展，多種有藥用價值的菌株、代謝產(chǎn)物不斷被發(fā)現(xiàn)。Rubalcava等［1］從馬鞭草(Callicarpa acuminata)內(nèi)生真菌Edenia gomezpompae中分離到具有化感素活性及抗真菌活性的萘醌(spiroketal)物質(zhì)。Rukachaisirikul等［2］報道，一種具有抗結(jié)核和抗真菌的活性化合物phomoenamide是由內(nèi)生真菌Phomopsis sp所產(chǎn)生的。因此，植物內(nèi)生菌在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。

藥用植物作為一類新的內(nèi)生菌來源正成為內(nèi)生菌研究者廣泛研究的對象。藥用植物內(nèi)生真菌的研究對于開發(fā)利用藥用植物及藥用植物資源的保護(hù)有著非常重要的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。青陽參(Cynanchum otophyllum Schneid)是蘿摩科鵝絨藤屬(Cynanchum Linn．)植物，屬多年生草本纏繞植物，根莖入藥，一直在云南民間流傳沿用，主產(chǎn)于云南中部、西北部和東北部地區(qū)。以青陽參為原料，現(xiàn)已開發(fā)出云南特色多種中成藥。有許多學(xué)者已對青陽參的化學(xué)成分，藥理毒理活性、含量測定，生藥學(xué)，繁殖技術(shù)和遺傳多樣性等進(jìn)行了深入研究［2－5］。但是，對于青陽參植物內(nèi)生菌的研究報道至今未見。筆者就青陽參植物內(nèi)生菌進(jìn)行分離和分類鑒定，以期為青陽參資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1供試植物樣品 植物樣品青陽參采自云南省楚雄市西山，海拔高度1 800 m。

1．2 培養(yǎng)基 細(xì)菌的分離培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 20 g，水 1 000 ml，pH自然，加入兩性霉素B以抑制真菌生長)。

真菌分離培養(yǎng)用PDA固體培養(yǎng)基(加入青霉素、鏈霉素以抑制細(xì)菌生長)，真菌鑒定用PDA固體培養(yǎng)基、促孢固體培養(yǎng)基(KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0．5 g、KNO31 g、KCl 0．5 g、淀粉 0．2 g、蔗糖 0．2 g、葡萄糖 0．2 g、瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 ml，pH 自然)。

1．3 內(nèi)生菌的分離、純化和培養(yǎng) 采集健康、新鮮的葉、莖和根組織樣品，沖洗干凈，并且吹干表面水分。取適量無菌水、75%乙醇、0．1%升汞，分別放入預(yù)先滅菌的燒杯中，將植物葉、莖和根剪成長段，備用。樣品先于75%乙醇中浸泡消毒，然后于0．1%升汞中浸泡消毒，將消毒完畢的樣品在無菌水中連續(xù)清洗后晾干，剪成小塊，用無菌的解剖刀從中間切開，使得植物內(nèi)部盡量暴露。將剪好的小塊分別接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA固體培養(yǎng)基平皿表面，同時用清洗消毒樣品的無菌水涂布為對照，分別于37和28℃培養(yǎng)，挑取植物組織周圍的菌落，對所分離的內(nèi)生菌進(jìn)行純化，并且根據(jù)菌落形態(tài)特征和個體形態(tài)特征進(jìn)行歸類培養(yǎng)［6］。

1．4 內(nèi)生菌的分類鑒定 內(nèi)生細(xì)菌的鑒定參照文獻(xiàn)［7－8］，同時依據(jù)菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色形態(tài)、莢膜和芽孢有無、動力學(xué)試驗(yàn)、生理生化特征等進(jìn)行研究。

真菌鑒定采用平板插片法，將菌種接種于固體PDA和促孢固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，菌落長出時斜插滅菌蓋玻片，培養(yǎng)后用鑷子取下蓋玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察顯微形態(tài)特征，鑒定到屬(分類檢索參照文獻(xiàn)［9－11］)。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同部位分離出內(nèi)生菌的數(shù)量分布 內(nèi)生菌在不同組織中種群、數(shù)量分布有差異，共分離出內(nèi)生菌56株，真菌34株，細(xì)菌22株;根中分離28株，莖中9株，葉中19株。在根、莖、葉中分別分離出細(xì)菌12、3、7株，分別分離出真菌18、4、12株。總的內(nèi)生菌分離結(jié)果為根部最多，莖中最少。

有些種屬在各個組織中均有分布，有些則表現(xiàn)出一定的組織專一性。葉中優(yōu)勢細(xì)菌種群為芽孢桿菌屬和泛菌屬，根中為土壤桿菌屬、假單胞桿菌屬和腸桿菌屬。葉中優(yōu)勢真菌種群為交鏈孢屬，根中優(yōu)勢種群為腐霉屬。

2．2 內(nèi)生菌種群組成多樣性 通過菌落形態(tài)、染色鏡檢等，初步鑒定22株內(nèi)生細(xì)菌屬于6個屬，包括土壤桿菌屬(Agrobacterium sp．)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp．)、泛菌屬(Pantoea sp．)、腸桿菌屬(Enterobacter sp．)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)，表明青陽參內(nèi)生細(xì)菌具有生物多樣性。

從植物根、莖和葉中，共分離獲得34株內(nèi)生真菌，其中25株內(nèi)生真菌經(jīng)形態(tài)學(xué)顯微觀察鑒定為12屬(表1)，說明青陽參植物內(nèi)生真菌種類繁多，微生物資源豐富。在科一級分類水平上，以叢梗孢科和暗梗孢科為優(yōu)勢類群;在屬的分類等級上，優(yōu)勢最明顯的是交鏈孢屬(Alternaria Nees)，共有6株，占總菌株17．6%，其次是腐霉屬(Pythium)，共有5株，占菌株總數(shù)的14．7%。

表1 青陽參植物內(nèi)生菌種群組成

3 結(jié)論

通過對青陽參植物內(nèi)生菌的分離、鑒定，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)生菌種類多、數(shù)量大，微生物資源豐富。該研究不僅為發(fā)現(xiàn)新種，而且為篩選出具有生物活性天然產(chǎn)物的內(nèi)生菌提供了豐富的資源。在青陽參植物不同的組織中內(nèi)生菌有不同的分布，表現(xiàn)出一定的組織專一性。這可能與不同組織的生理結(jié)構(gòu)和活性物質(zhì)有關(guān)。鑒于內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似活性代謝產(chǎn)物，該研究將有利于促進(jìn)植物內(nèi)生真菌資源的研究與應(yīng)用。隨著野生青陽參植物的日益減少，從內(nèi)生真菌出發(fā)，研究內(nèi)生真菌與其的相互關(guān)系，篩選能夠產(chǎn)生與宿主類似活性化合物的菌株，將具有重要的研究意義和應(yīng)用意義?？傊S著我國的傳統(tǒng)野生藥用植物資源的日漸枯竭，通過對藥用植物內(nèi)生菌的分類學(xué)、生態(tài)學(xué)、代謝產(chǎn)物化學(xué)等進(jìn)行系統(tǒng)的研究，將會極大地促進(jìn)藥用植物資源的開發(fā)和利用。

研究中存在的問題主要在于該次試驗(yàn)用的標(biāo)本植株量較少，也未對不同區(qū)域、不同季節(jié)植株進(jìn)行比較。內(nèi)生菌的鑒定還需要采用分子生物學(xué)手段如16SrRNA、18SrRNA和ITS序列分析等進(jìn)一步鑒定。這些工作還有待進(jìn)一步研究。隨著研究范圍的擴(kuò)大和研究的深入，更多的青陽參植物內(nèi)生菌將會被發(fā)現(xiàn)、應(yīng)用。

［1］RUBALCAVA M L M，BAUTISTA B E H，ESTRADA M J，et al．Naphthoquinone spiroketal with allelochemical activity from the newly discovered endophytic fungus Edenia gomezpompae［J］．Phytochemistry，2008，69:1185－1196．

［2］RUKACHAISIRIKUL V，SOMMART U，PHONGPAICHIT S，et al．Metabolites from the endophytic fungus Phomopsis sp．PSU-D15［J］．Phytochemistry，2008，69:783 －787．

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