枸杞黃酮對H2O2損傷的血管內(nèi)皮細胞NO及NOS作用的研究＊

廖國玲，馬 磊，曾 泰

（寧夏醫(yī)科大學檢驗學院，銀川750004）

血管內(nèi)皮細胞是血液與組織進行物質(zhì)交換的屏障，它通過合成與釋放大量的血管活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)血管的基礎(chǔ)張力，維持血管功能的正常。血管內(nèi)皮細胞的損傷和功能失調(diào)是動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生的始動環(huán)節(jié)［1］，對其損傷保護的研究是目前的熱點。自由基、活性氧、脂質(zhì)過氧化物、過氧化氫（H2O2）等均可引起內(nèi)皮細胞的損傷。抗氧化劑作為可終止自由基產(chǎn)生的一類化學物質(zhì)，被認為在預(yù)防心腦血管疾病及癌癥的發(fā)生中扮演著極其重要的作用［2］。對中草藥中天然活性成分的研究表明，一些黃酮類化合物具有抗氧化和抗癌作用。張自萍等［3］研究表明：寧夏產(chǎn)的枸杞黃酮化合物中蘆丁和綠原酸含量均高于河北、內(nèi)蒙古枸杞，且有明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用［4］。本研究選擇具有調(diào)節(jié)免疫能力、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抑菌、抗氧化等作用的枸杞黃酮化合物作為課題研究的對象［5－6］，深入研究其對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）氧化應(yīng)激損傷的保護機制。本實驗通過對枸杞黃酮對H2O2損傷的血管內(nèi)皮細胞一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）作用的研究，為開發(fā)利用枸杞及其有效成分提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥材與試劑 枸杞由寧夏農(nóng)科院提供，陳淑華研究員鑒定，其總黃酮由本研究室分離和純化［7］，含量經(jīng)測定為100mg/mL；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；四唑鹽（MTT）試劑為Sigma公司產(chǎn)品；NO試劑盒及NOS試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其余均為國產(chǎn)試劑（分析純級）。

1.1.2 實驗儀器 儀器CO2培養(yǎng)箱為美國Sheldon公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡Olympus產(chǎn)品，酶標儀為美國Me2tertech公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備 采用80%乙醇，60℃超聲提取，減壓濃縮，經(jīng)HPD－600型大孔樹脂，乙醇洗脫，減壓濃縮后，超純水定容為枸杞黃酮溶液［7－8］。以蘆丁為標準液繪制標準曲線，鋁鹽法測定總黃酮的濃度為100mg/mL。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 復蘇凍存的HUVEC細胞，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，將生長良好的HUVEC細胞用0.25%的胰蛋白酶消化1～2min后，用培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細胞壁制成細胞懸液，進行傳代培養(yǎng)用于實驗。

1.2.3 實驗分組 正常對照組：只加相應(yīng)體積培養(yǎng)液；H2O2損傷模型組（H2O2組）：在培養(yǎng)液中加入1 000μmol/L H2O2誘導損傷4h；枸杞黃酮干預(yù)組：依次分為枸杞黃酮低濃度組、枸杞黃酮中濃度組、枸杞黃酮高濃度組，先分別在培養(yǎng)液中加入終濃度為100、200、400mg/L的枸杞黃酮溶液孵育24h，再加入1 000μmol/L H2O2誘導損傷4h；維生素C（VitC）陽性對照組（VitC組）：在培養(yǎng)液中先加入終濃度為20mg/L的VitC孵育24h，再加入1 000μmol/L H2O2誘導損傷4h。

1.2.4 MTT法檢測HUVEC活力 實驗結(jié)果以 MTT的光密度（OD）值計算內(nèi)皮細胞生長抑制率（IR）。IR＝（對照組OD－實驗組OD）/對照組OD×100%。

1.2.5 細胞培養(yǎng)液中過氧化物丙二醛（MDA）、人總一氧化氮合成酶（TNOS）、誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）和NO的測定 按實驗分組所述方法處理后，收集細胞培養(yǎng)上清液，分別按MDA、NOS和NO測定試劑盒中說明書上所述的方法分別檢測MDA、TNOS、iNOS和NO的活性，試驗重復3次，每次4個復孔，取均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 枸杞黃酮對H2O2誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞活力的影響H2O2處理HUVEC后其細胞IR為38.8%，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與H2O2組比較，枸杞黃酮低、中、高濃度組IR顯著降低（P＜0.01），與枸杞黃酮呈劑量依賴性，見表1。

表1 枸杞黃酮對H2O2誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞活力的影響（n＝4）

表2 枸杞黃酮對H2O2誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞MDA、NOS、iNOS活性及NO含量的影響（±s，n＝4）

表2 枸杞黃酮對H2O2誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞MDA、NOS、iNOS活性及NO含量的影響（±s，n＝4）

a：P＜0.01，與正常對照組比較；b：P＜0.01，c：P＜0.05，與H2O2組比較。

組別 NO（μmol/L）TNOS（U/mL）iNOS（U/mL）MDA（nmol/mL）正常對照組 55.69±8.12b 1.10±0.10b 0.81±0.06b 0.418±0.042b H2O2 組 19.05±6.27a1.78±0.07a1.33±0.06a2.216±0.062a VitC組 39.11±3.09b 1.32±0.06b 0.99±0.06b 1.304±0.105b枸杞黃酮低濃度組 28.15±5.71c 1.59±0.04b 1.16±0.08b 1.796±0.155b枸杞黃酮中濃度組 33.25±3.94b 1.49±0.07b 1.07±0.05b 1.674±0.054b枸杞黃酮高濃度組 37.27±3.72b 1.40±0.07b 1.01±0.06b 1.427±0.106b

2.2 枸杞黃酮對H2O2誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞活力培養(yǎng)上清液中MDA、TNOS、iNOS活性和NO含量的影響與正常對照組比較，H2O2組細胞培養(yǎng)液中細胞內(nèi)MDA含量增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而枸杞黃酮各濃度組細胞 MDA生成減少，其變化程度與枸杞黃酮濃度呈正比，與H2O2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。H2O2組細胞培養(yǎng)液中細胞內(nèi)NO含量降低，TNOS（結(jié)構(gòu)型和誘導型）活性升高，尤以iNOS活性升高為主，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而枸杞黃酮各濃度組細胞內(nèi)TNOS、iNOS活性降低，NO生成增多，與H2O2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。

3 討 論

造成血管內(nèi)皮細胞損傷的因素有很多，其中氧化應(yīng)激是造成血管內(nèi)皮損傷較為重要的因素之一，H2O2是體內(nèi)常見的一種活性氧，可促進自由基生成，直接作用于細胞膜脂質(zhì)，造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，致使細胞膜的損傷［9］。MTT參與活細胞的能量代謝，直接反映活細胞的數(shù)量和活性［10］。機體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)包括酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，NO為內(nèi)皮源性舒血管因子，由NOS催化L－精氨酸和分子氧而合成。內(nèi)皮細胞有兩種NOS，即iNOS（誘導型）、cNOS（內(nèi)皮型），外源刺激可影響NOS活性或表達，進而影響NO產(chǎn)生與釋放。iNOS在無病理性刺激時表達通常較低或無表達，其表達調(diào)節(jié)主要在轉(zhuǎn)錄水平，許多物質(zhì)可上調(diào)或下調(diào)表達。cNOS在細胞中結(jié)構(gòu)性表達，一些病理性刺激對其表達也有調(diào)節(jié)作用［11］。烏蘭格日樂等［12］研究發(fā)現(xiàn)枸杞黃酮的抗氧化作用與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，羥基化是其抗氧化活性不可缺少的。研究證明黃酮類化合物可顯著降低高脂大鼠血漿氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和MDA水平，提高超氧化物歧化酶（SOD）活力，進而達到保護內(nèi)皮細胞的功效［13］。賈剛等［14］研究發(fā)現(xiàn)不同種類的枸杞黃酮對于細胞的氧化應(yīng)激具有完全不同的作用，而且黃酮對細胞氧化應(yīng)激的作用與其濃度呈現(xiàn)出很好的相關(guān)性。

本研究采用H2O2誘導HUVEC建立內(nèi)皮細胞氧化損傷模型。研究結(jié)果表明H2O2組內(nèi)皮細胞的存活率明顯下降，IR為38.8%。加入不同濃度梯度的枸杞黃酮各組其細胞生長抑制率呈下降趨勢，即枸杞黃酮呈劑量依賴性（P＜0.01）。內(nèi)皮細胞在H2O2刺激下，與正常對照組相比，MDA含量明顯增加；加入100、200、400mg/L枸杞黃酮預(yù)先干預(yù)，與H2O2組相比，MDA含量明顯降低（P＜0.01）。而MDA是自由基與生物膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，它的含量反映氧自由基的水平及脂質(zhì)過氧化程度，因此，MDA含量的降低說明枸杞黃酮可通過抑制過氧化而減輕H2O2造成的細胞損傷；同樣，H2O2組NO較正常對照組比較較低，隨著枸杞黃酮的量增加呈上升趨勢，損傷后iNOS表達增強，枸杞黃酮各組iNOS表達與NO的生成呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。推測NO升高與cNOS表達有關(guān)［11］，即枸杞黃酮可能促進了血管壁cNOS的表達，使iNOS的表達下降，有利于生理性的NO合成并發(fā)揮作用，使其減輕H2O2對HUVEC的氧化作用，增加NO的生成，其保護機制可能為通過清除自由基，有效提高機體抗氧化酶的活性來修復受損的內(nèi)皮細胞，調(diào)節(jié)細胞表達NOS，催化促進NO的合成有關(guān)。與此同時，本研究也推測枸杞黃酮在調(diào)節(jié)NO對內(nèi)皮細胞保護的同時，過高的NO水平也會協(xié)同H2O2而引起血管內(nèi)皮細胞的損傷，即枸杞黃酮通過調(diào)節(jié)NO保護內(nèi)皮細胞具有雙面性，而且已經(jīng)有不少動物實驗發(fā)現(xiàn)某些黃酮化合物具有毒性，且其毒性與促氧化作用密不可分［15］。這種誘導細胞損傷可能與以下機制有關(guān)：（1）NO作用于鐵蛋白，影響細胞呼吸及能量代謝；參與過氧化脂質(zhì)的形成［16］，加速過氧化亞 硝 基 陰 離 子（ONOO－）等 羥 自 由 基（O H·）等氧化劑的生成；（2）NO及其中間反應(yīng)產(chǎn)物還可激活核修復多聚酶，抑制DNA合成，間接激活蛋白酶激活受體，引起無效修復，最終導致生物能量耗竭，致使細胞死亡［17］。綜上所述，枸杞黃酮對 H2O2損傷的血管內(nèi)皮細胞NO及NOS作用的研究的作用還有待于進一步研究。

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