人參皂苷Rh2 抑制肝癌HepG2 細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究

馮子強(qiáng) 左國(guó)偉 石慶強(qiáng) 趙綠翠 羅 念 游智梅 夏 菁 李丹陽(yáng) 李 靜 陳地龍

(重慶醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，干細(xì)胞與組織工程研究室，重慶 400016)

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，同時(shí)也是世界范圍內(nèi)的一種嚴(yán)重危害人類(lèi)生命的多發(fā)性惡性腫瘤［1，2］。原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)早期易于發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是肝癌細(xì)胞重要的生物學(xué)行為。HCC 易發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，是制約臨床治療效果的重要因素，且預(yù)后不佳［3］。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞組織的正常結(jié)構(gòu)，從而有利于腫瘤細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。而組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)能特異性結(jié)合MMP，并將其降解，起到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［4］。

人參皂苷Rh2 (Ginsenoside Rh2)是從人參中提取的天然活性成分，分子式為C36H62O8H2O，分子質(zhì)量622，化學(xué)名為20(S)-人參二醇-3-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，以往研究已經(jīng)證實(shí)了它能在多個(gè)環(huán)節(jié)上抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等［5，6］。據(jù)Tang 報(bào)道［7］，人參皂苷Rh2 也能抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的發(fā)生，但其作用機(jī)制及其作用機(jī)理尚不完全清楚，為進(jìn)一步探討人參皂苷抗腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)理我們作了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人參皂苷Rh2 購(gòu)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)，純度99%;DMEM-F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)于HyClone 公司;DMSO 購(gòu)于Merk 公司;96 孔板購(gòu)于BIOFIL 公司;BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、BeyoECL Puls(超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒)購(gòu)于Sigma 公司，0.45 μm PDVF 膜購(gòu)于Millipore 公司;CCK-8 細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于DOJINDO研究所，熒光素報(bào)告基因［(pGR-luc)，(pAP1-luc)，(pMYC-luc)，(pTCF/LEF-luc)，(pRBP/JK-luc)，(pSTAT-luc)，(pHIF-luc)，(pE2F/DP1-luc)，(pSMAD-luc)，(pNFAT-luc)］由重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系左國(guó)偉教授提供，脂質(zhì)體購(gòu)于TaKaRa 公司，熒光素酶購(gòu)于TaKaRa 公司，小鼠抗人Beta-actin 購(gòu)于北京中衫金橋公司，兔抗人P-ERK、P-P38、P-JUK、ERK、P-38、JUK、AP1、MMP3 購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存，以1 ×107ml-1接種于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d 傳代一次。

20 mg Rh2 溶于1 ml DMSO 配制成160 mmol/L的儲(chǔ)存液，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用含10%胎牛血清的DMEM-F12 稀釋至相應(yīng)濃度(DMSO 終體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)0.1%)。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，以1 ×104/孔的密度接種于96 孔板中，24 h 后藥物組分別加入不同濃度的Rh2(10～160 μmol/L);空白組只加入最大劑量0.1%DMSO的DMEM-F12 培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含等量細(xì)胞的DMEM-F12 培養(yǎng)液。每濃度組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入20 μl 的CCK-8 液體，放回孵箱，孵育3 h，用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)檢測(cè)每孔的吸光度(A)值，計(jì)算藥物對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制率，抑制率(IR%)=［1-藥物組(A)］/對(duì)照組(A)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，篩選出Rh2 最適作用時(shí)間和濃度。

1.2.3 用Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞，Rh2(80 μmol/L)處理24 h，以1 ×104個(gè)接種于上室，下室含有10%胎牛血清的DMEMF12，孵育24 h，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，采集圖片。

1.2.4 用熒光報(bào)告基因檢測(cè)信號(hào)通路 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞，以1 ×106ml-1的密度接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用無(wú)血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基洗3 次，重新加入950 μl 無(wú)血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基，并加入脂質(zhì)體與熒光報(bào)告基因質(zhì)粒，孵育4 h，取出上清液，重新加入含10%胎牛血清的DMEMF12，過(guò)夜后藥物組加入Rh2(80 μmol/L)，分別于6、12、24、48 h 后檢測(cè)熒光素活性。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)HepG2 細(xì)胞中P-ERK、ERK、P-P38、P-38、P-JUK、JUK、MMP3 蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞，以1 ×107ml-1的密度接種，待細(xì)胞貼壁后，藥物組加入Rh2(80 μmol/L)，設(shè)空白對(duì)照組并加入最大劑量0.1%DMSO，分別培養(yǎng)6、12、24、48 h 后，用0.25%胰酶消化，收集各處理組細(xì)胞，提取總蛋白，用蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，用Bio-Rad 的方法定量蛋白。取50 μg 蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)到PDVF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，兔抗人抗體P-ERK、ERK、P-P38、P-38、P-JUK、JUK、MMP3(1∶1 000)，小鼠抗人Beta-actin(1∶2 000)4℃孵育過(guò)夜，用TBST 緩沖液漂洗，分別加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)和山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，37℃孵育1.5 h，TBST 緩沖液漂洗后用ECL 顯色劑顯色、曝光，運(yùn)用Quantity One 圖像分析軟件測(cè)得條帶的吸光度值，將各組的目的條帶和內(nèi)參比值后，比較各組間差異。

1.2.6 用定量PCR 方法分別檢測(cè)AP1、MMP3 基因的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞，以1 ×107ml-1的密度接種，24 h 后，藥物組加入Rh2(80 μmol/L)，設(shè)空白對(duì)照組并加入最大劑量0.1% DMSO，分別培養(yǎng)6、12、24、48 h 后，用0.25%胰酶消化，收集各處理組細(xì)胞，提取總的RNA，測(cè)出RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄成功后進(jìn)行定量分析。AP1:Forward:GCAAACCTCAGCAACTTCAACC;Reverse:GCATCTCGGGCACTGTCTGA;MMP3:Forward:TAATGGAGATGCCCACTTTGATG;Reverse:GAGTGAAAGAGACCCAGGGAGTG。

1.2.7 用熒光顯微鏡分別觀察AP1，MMP3 蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞，以1 ×107ml-1的密度接種，在6 孔板中置放無(wú)菌玻片，24 h 后，藥物組加入Rh2(80 μmol/L)，設(shè)空白對(duì)照組并加入最大劑量0.1%DMSO，每組平行接種3 個(gè)復(fù)孔，用4%多聚甲醛固定，用0.3%Triton-100 破膜，山羊血清封閉，分別加入AP1(1∶50)，MMP3(1∶100)，過(guò)夜，第二天加入抗兔熒光二抗，孵育1 h，用PI 染色，50%甘油封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以±s 表示，多組間采用兩因素方差分析和單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rh2 可抑制HepG2 細(xì)胞的增殖 采用CCK-8 法，經(jīng)酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，而加藥組在給予Rh2(10～160 μmol/L)后HepG2 細(xì)胞增殖受到抑制，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性(圖1)。與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.2 Rh2 可抑制HepG2 細(xì)胞的遷移 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)Rh2(80 μmol/L)作用于HepG2細(xì)胞24 h 后，與空白對(duì)照組相比較，加藥組穿越過(guò)基膜的細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖2)。

圖1 Rh2 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of RH2 on proliferation inhibition rate of HepG2

圖2 Rh2 可抑制HepG2 細(xì)胞的遷移Fig.2 Effect of Rh2 on migration ability of HepG2

圖3 檢測(cè)HepG2 細(xì)胞中(pAP1-luc)，(pGR-luc)，(pMYC-luc)，(pTCF/LEF-luc)，(pRBP/JK-luc)，(pSTAT-luc)，(pHIF-luc)，(pE2F/DP1-luc)，(pSMAD-luc)，(pNFAT-luc)熒光素的活性Fig.3 Renilla luciferase activities of (pAP1-luc)，(pGR-luc)，(pMYC-luc)，(pTCF/LEF-luc)，(pRBP/JK-luc)，(pSTATluc)，(pHIF-luc)，(pE2F/DP1-luc)，(pSMAD-luc)，(pNFAT-luc)were assayed by Luciferase Reporter Assay system reagent

2.3 熒光素報(bào)告基因檢測(cè)信號(hào)通路 熒光素報(bào)告基因結(jié)果顯示(圖3):在10 條信號(hào)通路中，(pAP1-luc)轉(zhuǎn)染在HepG2 細(xì)胞后，熒光素的表達(dá)分別在6、12、24、48 h 顯著升高，而(pGR-luc)、(pMYC-luc)、(pTCF/LEF-luc)、(pRBP/JK-luc)、(pSTAT-luc)、(pHIF-luc)、(pE2F/DP1-luc)、(pSMAD-luc)、(pNFAT -luc)轉(zhuǎn)染在HepG2 細(xì)胞后，熒光素的表達(dá)在6、12、24、48 h 升高不明顯，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)Rh2(80 μmol/L)處理(pAP1-luc)轉(zhuǎn)染的HepG2 細(xì)胞后與(pAP1-luc)轉(zhuǎn)染組相比熒光素的表達(dá)分別在6、12、24、48 h 顯著降低。故我們推測(cè)AP1 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞有著重要作用，讓我們感興趣的是Rh2 能抑制AP1 轉(zhuǎn)錄因子。

2.4 Western blot 檢測(cè)HepG2 細(xì)胞中P-ERK、ERK、P-P38、P-JUK、JUK、MMP3 蛋白的表達(dá) Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4，5)，Rh2(80 μmol/L)經(jīng)不同時(shí)間(6、12、24、48 h)作用于HepG2 細(xì)胞后，與空白對(duì)照組相比較，HepG2 細(xì)胞P-ERK、MMP3 蛋白表達(dá)水平均明顯下降，P-JUK、P-P38 蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，ERK、P-38、JUK 的表達(dá)水平則無(wú)明顯差異。

2.5 用定量PCR 方法分別檢測(cè)AP1、MMP3 基因的表達(dá) 定量熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6)，Rh2(80 μmol/L)經(jīng)不同時(shí)間(6、12、24、48 h)作用于HepG2細(xì)胞后，與空白對(duì)照組相比較加藥組HepG2 細(xì)胞AP1、MMP3 基因的表達(dá)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。

2.6 用熒光顯微鏡分別觀察AP1，MMP3 蛋白的表達(dá) 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示(圖7):經(jīng)Rh2(80 μmol/L)作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，與空白對(duì)照組相比較，加藥組HepG2 細(xì)胞的AP1、MMP3 蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)顯著減少。

圖4 Western blot 檢測(cè)HepG2 細(xì)胞中P-ERK、ERK、P-P38、P-JUK、JUK、MMP3 蛋白的表達(dá)Fig.4 Effect of Rh2 on expression of P-ERK，ERK，PP38，P-JUK，JUK and MMP3 proteins

圖5 定量PCR 方法分別檢測(cè)AP1，MMP3 基因的表達(dá)(±s，n=3)Fig.5 Effect of Rh2 on expression of AP1，MMP3 genes(±s，n=3)

圖6 熒光顯微鏡法分別檢測(cè)AP1，MMP3 蛋白的表達(dá)Fig.6 Effect of Rh2 on expression of AP1，MMP3 fluorescence proteins

3 討論

人參作為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的一種“補(bǔ)氣”藥物使用已有上千年歷史，近年在各種腫瘤治療中作為一種輔助性治療藥物在應(yīng)用。RH2 作為人參總皂苷成份之一，研究表明它能促進(jìn)胰腺癌、肝癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞的凋亡［8］，但是它對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移是否有影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。我們此次實(shí)驗(yàn)的目的是進(jìn)一步討論人參皂苷Rh2 對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞的遷移作用。

我們采用了CCK-8 法檢測(cè)人參皂苷Rh2 對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rh2 能有效抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖，并呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。

在研究中，我們采用Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)M了腫瘤細(xì)胞的體外侵襲和遷移，實(shí)驗(yàn)中觀察到HepG2細(xì)胞有很強(qiáng)的侵襲遷移能力，80 μmol/L Rh2 作用于HepG2 細(xì)胞后，能顯著減少穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，提示Rh2 能有效抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。

熒光素報(bào)告基因在篩選藥物研究方面應(yīng)用廣泛，同時(shí)也是一種分析轉(zhuǎn)錄因子和特異性啟動(dòng)子方法［9］。我們應(yīng)用十種熒光素報(bào)告基因去篩選人參皂苷Rh2 作用于肝癌HepG2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，讓我們感興趣的是在肝癌HepG2 細(xì)胞中AP1 轉(zhuǎn)錄因子處于高表達(dá)狀態(tài)，更令我們驚訝的是Rh2 能抑制AP1 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，因此我們?cè)O(shè)想Rh2 可能是通過(guò)抑制AP1 轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的遷移。隨后我們又用免疫熒光去檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)的AP1 轉(zhuǎn)錄因子，也發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，加藥組AP1 轉(zhuǎn)錄因子的熒光強(qiáng)度明顯減弱。

AP1 轉(zhuǎn)錄因子由是多聚體(JUN、FOS、JTF、MAF)構(gòu)成的復(fù)合物，JUN、FOS 構(gòu)成聚合物是一種癌基因蛋白，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［10，11］。我們通過(guò)Western blot 檢測(cè)了AP1 轉(zhuǎn)錄因子的上游信號(hào)通路MAPK(ERK、JUK、P38)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同時(shí)間加藥組(6、12、24、48 h)作用于HepG2 細(xì)胞后，與空白對(duì)照組相比較，P-ERK 蛋白表達(dá)水平均明顯下降，P38、JUK 蛋白表達(dá)水平均明顯升高，MAPK 通路的異?；罨軐?dǎo)致細(xì)胞喪失凋亡和分化的能力，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，異常增殖，產(chǎn)生腫瘤，并能促使腫瘤進(jìn)一步增殖，這表明Rh2 對(duì)MAPK 信號(hào)通路的調(diào)控對(duì)治療腫瘤有一定意義，同時(shí)我們檢測(cè)了AP1 轉(zhuǎn)錄因子的下游信號(hào)通路MMP3［12］。MMPs 是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白水解酶，主要的作用底物是Ⅳ型膠原，通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，從而參與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程，因而與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切，故我們用Western blot 檢測(cè)了MMP3［13］。不同時(shí)間加藥組(6、12、24、48 h)作用于HepG2 細(xì)胞后，與對(duì)照組相比較，MMP3 蛋白明顯降低，同時(shí)我們也檢測(cè)MMP3 的基因表達(dá)，與對(duì)照組相比較，藥物組的MMP3 基因表達(dá)顯著降低;免疫熒光檢測(cè)結(jié)果也顯示，與對(duì)照組相比較，藥物組的MMP3 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯著減少。

綜上所述，人參皂苷Rh2 抑制肝癌HepG2 細(xì)胞遷移是通過(guò)MAPK 通路抑制AP1 轉(zhuǎn)錄因子從而降低MMP3 的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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