胃癌細(xì)胞中長鏈非編碼RNA SNHG5與miR-26b間的相互作用

李延爽，趙連梅，孫佳增，劉彥信，鄭德先，史 娟

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005)

LncRNA 是一種長度大于200nt 的功能RNA，無蛋白質(zhì)編碼功能，越來越多的證據(jù)表明lncRNA在胃癌中異常表達(dá)，且與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、診斷及預(yù)后高度相關(guān)。SNHG5 是長度為524 bp 的lncRNA，為snoRNA U50 和U50'的宿主基因外顯子的成熟剪接體，U50 位于染色質(zhì)基因組斷點(diǎn)位置［1］。U50 在多種癌癥中被證實(shí)其與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)［2］，可作為篩選腫瘤相關(guān)基因的重要指標(biāo)。因此作為U50 宿主基因成熟剪接體的SNHG5 可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。

MicroRNA 是一種長度為19～23 nt 的內(nèi)源性小分子。miR-26b 在大多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)［3］，同時(shí)miR-26b 能夠通過靶向CDK8 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［4］。ceRNA(competing endogenous RNA)通過競爭性結(jié)合microRNA 來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，是RNA 間相互作用的一種新機(jī)制。胃癌中l(wèi)ncRNA HOTAIR 可通過結(jié)合miR-331-3p 來調(diào)節(jié)HER2 的表達(dá)［5］;過表達(dá)lncRNA GAS5 可抑制miR-21 的表達(dá)但對其前體的表達(dá)沒有影響［6］。目前關(guān)于microRNA 與lncRNA 間相互作用的研究較少。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG5 可與miR-26b 的種子序列結(jié)合，因此本研究選取SNHG5 和miR-26b 作為研究對象，旨在探討miR-26b 與lncRNA SNHG5 在胃癌細(xì)胞中的相互作用，進(jìn)而為胃癌的發(fā)生發(fā)展及其治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清(Hyclone 公司)，RPMI1640 培養(yǎng)基(Life Technologies 公司)，lipofectamine 2000 和Trizol(Invitrogen 公司)，反轉(zhuǎn)錄緩沖液、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶及RNA 酶抑制劑(Promega 公司)，2 × qPCR mix(Takara 公司)，Taq Man Small RNA Assays 試劑盒(Applied Biosystems 公司)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建SNHG5 過表達(dá)質(zhì)粒:在SNHG5 序列兩端除poly A 尾外的序列處設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，經(jīng)PCR 方法擴(kuò)增SNHG5 全長序列，將全長序列克隆至真核過表達(dá)載體pSilencerTM-CMV。經(jīng)測序正確后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:SNHG5 過表達(dá)質(zhì)粒4 μg 或miR-26b mimics(100 nm)及其對照質(zhì)粒或NC mimics(100 nm)分別與無血清1640 培養(yǎng)基混合，最終體積為250 μL。同時(shí)將4 μL lipofectamine 2000 與246 μL無血清培養(yǎng)基混合，充分混勻后在室溫靜置5 min。將含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基與質(zhì)?；騧imics 的培養(yǎng)基混合并充分混勻，靜置20 min，均勻的將混合物滴加至含500 μL 無血清培養(yǎng)基的6 孔板中，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后用于提取細(xì)胞總RNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測SNHG5 的表達(dá):用Trizol法提取細(xì)胞總RNA(按照Trizol 說明書操作)。Nanodrop 紫外分光光度計(jì)測定RNA 的濃度及純度，以1 μg 總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃5 min，95 ℃15 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)40次。miR-26b 的檢測以U6 為內(nèi)參，檢測SNHG5 表達(dá)情況以GAPDH 為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以2－△△Ct法進(jìn)行分析。所用引物(表1)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 Taq Man 定量PCR 檢測microRNA 的表達(dá)變化:將以Trizol 法提取的細(xì)胞總RNA 作為反轉(zhuǎn)錄模板，參照Applied Biosystems 公司TaqMan Small RNA Assays 說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以及PCR 檢測，Taq Man 定量PCR 反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為50 ℃2 min，95 ℃10 min，40 個(gè)循環(huán)(95 ℃15 s，60 ℃60 s)，以U6 為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以2－△△Ct法進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 PCR 引物序列Table 1 The primer sequences

2 結(jié)果

2.1 SNHG5 在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)

SNHG5 在胃癌細(xì)胞SNU-1、MGC-803、HGC-27、SGC-7901、MKN-45 和MKN-28 中的表達(dá)均高于在GES-1 細(xì)胞中的表達(dá)(P＜0.05)(圖1)。

圖1 SNHG5 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)明顯高于在正常胃上皮細(xì)胞GES-1 中的表達(dá)Fig 1 Expression level of SNHG5 in gastric cancer cells is significantly higher than that in normal gastric epithelial cell GES-1(±s，n=3)

2.2 過表達(dá)SNHG5 可抑制miR-26b 及pri-miR-26b 的表達(dá)

SNHG5 序列上存在miR-26b 種子序列的結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。過表達(dá)SNHG5 后，miR-26b(圖2B)的水平明顯下降(P＜0.01)，pri-miR-26b(圖2C)的表達(dá)也受到顯著抑制(P＜0.01)。

圖2 SNHG5 過表達(dá)抑制miR-26b 和pri-miR-26b的表達(dá)Fig 2 SNHG5 suppressed the expression of miR-26b and pri-miR-26b(±s，n=3)

2.3 過表達(dá)miR-26b mimics 不能抑制SNHG5 的表達(dá)

MGC-803 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26b mimics 后，miR-26b的表達(dá)明顯高于對照組(P＜0.01)(圖3A)，SNHG5 的表達(dá)基本不變(圖3B)。

3 討論

圖3 miR-26b 不能影響SNHG5 的表達(dá)Fig 3 miR-26b could not affect the expression of SNHG5(±s，n=3)

LncRNA 在基因組中普遍發(fā)生轉(zhuǎn)錄，可參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的幾乎各個(gè)過程，然而lncRNA 在很多疾病中的作用機(jī)制還不是很清楚。SNHG5 作為位于染色質(zhì)基因組斷點(diǎn)U50 的宿主基因外顯子的剪接體，可能是重要的腫瘤相關(guān)基因。SNHG5 在經(jīng)X-線照射的TK6 細(xì)胞及其鄰近的未經(jīng)照射的細(xì)胞中表達(dá)均發(fā)生顯著變化［7］。因此SNHG5 可能在腫瘤中發(fā)揮重要作用。

本研究首先檢測到SNHG5 在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，而通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-26b 與SNHG5 間存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-26b 在乳腺癌組織中通過作用于CDK8 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［4］，在肝癌細(xì)胞中能夠抑制NF-κB 信號通路，同時(shí)通過靶作用于TAK1 和TAB3 而增強(qiáng)細(xì)胞的化學(xué)敏感性［8］，在全血中可作為檢測胰腺癌的重要生物標(biāo)志［9］，這些已有結(jié)果提示研究SNHG5 和miR-26b 之間的相互作用將在胃癌的治療中發(fā)揮重要作用。在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)SNHG5 能夠抑制miR-26b 及primiR-26b 的表達(dá)，隨后檢測到在過表達(dá)miR-26b 的MGC-803 細(xì)胞中SNHG5 的表達(dá)沒有發(fā)生顯著變化。結(jié)果提示SNHG5 抑制miR-26b 及pri-miR-26b 的表達(dá)可能是通過其他更復(fù)雜的機(jī)制發(fā)生作用，而不是通過兩者的直接結(jié)合。

目前關(guān)于lncRNA 與miRNA 間相互作用的研究甚少，lncRNA 與miRNA 相互作用的復(fù)雜性可能是由于它們在細(xì)胞核內(nèi)形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA 通過作用于網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的其他成員而抑制miRNA 的表達(dá)。ceRNA 假說揭示了RNA 間相互作用的新機(jī)制，lncRNA HOTAIR 通過結(jié)合miR-331-3p 抑制其表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)miR-331-3p 靶基因HER2 的表達(dá)，lncRNA H19 通過與miR-19a 相互作用影響MYCN 的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG5 可抑制miR-26b 及pri-miR-26b的表達(dá)，為lncRNA 與miRNA 間相互作用的研究奠定了基礎(chǔ)，為胃癌的發(fā)生發(fā)展及其治療提供了新的研究方向。

［1］Tanaka R，Satoh H，Moriyama M，et al.Intronic U50 small-nucleolar-RNA (snoRNA)host gene of no proteincoding potential is mapped at the chromosome breakpoint t(3;6)(q27;q15)of human B-cell lymphoma［J］.Genes Cells，2000，5:277-287.

［2］Pacilli A，Ceccarelli C，Treré D，et al.SnoRNA U50 levels are regulated by cell proliferation and rRNA transcription［J］.Int J Mol Sci，2013，14:14923-14935.

［3］Li J，Kong XJ，Zhang JF，et al.MiRNA-26b inhibits proliferation by targeting PTGS2 in breast cancer［J］.Cancer Cell Int，2013，13:1-7.

［4］Li J，Li XY，Kong XJ，et al.MiRNA-26b inhibits cellular proliferation by targeting CDK8 in breast cancer［J］.Int J Clin Exp Med，2014，7:558-565.

［5］Liu XH，Sun M，Nie FQ，et al.Lnc RNA HOTAIR functions as a competing endogenous RNA to regulate HER2 expression by sponging miR-331-3p in gastric cancer［J］.Mol Cancer，2014，13:92.doi:10.1186/1476-4598-13-92.

［6］Zhang Z，Zhu Z，Watabe K，et al.Negative regulation of lncRNA GAS5 by miR-21［J］.Cell Death Differ，2013，20:1558-1568.

［7］Chaudhry MA.Small nucleolar RNA host genes and long non-coding RNA responses in directly irradiated and bystander cells［J］.Cancer Biother Radiopharm，2014，29:135-141.

［8］Zhao N，Wang RZ，Zhou LJ，et al.MicroRNA-26b suppresses the NF-κB signaling and enhances the chemosensitivity of hepatocellular carcinoma cells by targeting TAK1 and TAB3［J］.Mol Cancer，2014，13:35.doi:10.1186/1476-4598-13-15..

［9］Schultz NA，Dehlendorff C，Jensen BV，et al.MicroRNA biomarkers in whole blood for detection of pancreatic cancer［J］.JAMA，2014，311:392-404.