TRPC1是人氣道上皮細胞感受壓力的受體

何 葉，李 娜，黎 力，李敏超*

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1.呼吸內(nèi)科;2.胸心外科，重慶400010)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和支氣管哮喘等慢性氣道炎性反應(yīng)疾病患者由于氣道重塑、支氣管管腔內(nèi)黏液增多和支氣管平滑肌痙攣等多種因素，使小氣道內(nèi)存在持續(xù)異常增高的氣道內(nèi)壓力。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，壓力刺激與氣道上皮高分泌、氣道重塑、氣道炎性反應(yīng)密切相關(guān)［1-3］，可見，持續(xù)異常的氣道高壓貫穿于慢性阻塞性肺疾病始終，與疾病的病情進展密切相關(guān)，但關(guān)于氣道感受壓力刺激的受體機制尚不清楚。瞬時感受器電位(transient receptor potential，TRP)廣泛分布在細胞膜及細胞器膜上，其中TRPC1 是細胞上的一種重要機械敏感離子通道(mechanosensitive cation channel，MscCa)［4-5］，在壓力負荷作用致心肌重構(gòu)的病理變化過程中有重要的作用。通過免疫熒光及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)技術(shù)，已發(fā)現(xiàn)人肺泡上皮細胞上亦有大量TRPC1 表達［6］。因此TRPC1 介導(dǎo)的信號通路可能是氣道上皮細胞感受氣道高壓的重要機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗人TRPC1 抗體(Abcam 公司);兔抗GAPDH單克隆抗體和山羊抗兔IgG 抗體、Fluo3-AM(碧云天生物技術(shù)研究所);PrimeScript RT reagent Kit 試劑盒、SYBR Premix EX TaqTM、DL2000 marker、Trizol 試劑盒、TRPC1 引物(TaKaRa Biotechnology 公司);正常人支氣管上皮16HBE 細胞(ATCC 公司);1640 培養(yǎng)液、胎牛血清(Hyclone 公司);TRPC1 siRNA、NC siRNA(廣州銳博公司)，Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Invitrogen 公司)。

1.2 組織標本

收集因肺癌于2014年3月至2014年9月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胸外科行肺葉切除術(shù)患者肺組織，共20 例，取自距離腫塊5 cm 以上肺癌旁組織，經(jīng)HE 染色證實無癌性病變。所有患者均被告知研究項目內(nèi)容并簽字同意參與本研究，該研究亦取得倫理委員會批準。

組織標本根據(jù)患者術(shù)前臨床表現(xiàn)，依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會2013 診斷指南分為COPD 組、支氣管哮喘組和對照組(無其他慢性氣道炎性反應(yīng)疾病)。COPD 組8 例，男5 例，女3 例，平均年齡(62.4 ±10.2)歲(54～69 歲);支氣管哮喘5 例，男3 例，女2 例，平均年齡(59.2 ± 3.4)歲(56～62歲);對照組7 例，男4 例，女3 例，平均年齡(60.1 ±7.31)歲(50～69 歲)。各組間年齡、性別、吸煙者所占比例均無統(tǒng)計學(xué)差異。用于Western blot 及qRTPCR 檢測的支氣管組織用薄刀片在顯微鏡下快速切取支氣管黏膜組織，置于液氮罐中保存?zhèn)溆?。用于免疫組織化學(xué)檢測的肺組織標本則用10%多聚甲醛固定，常溫保存。

1.3 人氣道上皮細胞TRPC1 表達水平檢測

1.3.1 免疫組化SP 法檢測TRPC1 表達水平:常規(guī)步驟制蠟塊、切片、脫蠟水化。參照SP kit 試劑盒說明書進行免疫組化(兔抗TRPC1 多克隆抗體按1∶2稀釋，陰性對照組則加入非免疫源性正常兔IgG)。用Imagepro-Plus 軟件進行結(jié)果分析。選取整個支氣管黏膜上皮作為測量區(qū)域，圖像中黃色區(qū)域作為AOI 進行累積光密度(integrated optical，IA)測定分析。以IA/測量面積(area)值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。每張切片均在高倍鏡下(×400)選擇5 個視野，其平均值即為該標本的支氣管黏膜上皮內(nèi)TRPC1 蛋白含量。

1.3.2 Western blot 方法檢測支氣管黏膜上皮中TRPC1 蛋白表達水平:用細胞裂解液提取支氣管組織總蛋白。采用BCA 法測定總蛋白濃度，行12%SDS-PAGE 分離蛋白，印跡轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加兔抗TRPC1 多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗GAPDH單克隆抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過夜;洗膜后，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)于37 ℃孵育1 h。ECL 發(fā)光劑顯影，掃描并存像。結(jié)果用Quantity One 分析軟件行灰度分析，以與GAPDH 產(chǎn)物條帶的比值作為蛋白的相對含量。

1.3.3 qRT-PCR 測定支氣管黏膜上皮TRPC1 mRNA 表達水平:采用Trizol 法分別提取組織細胞內(nèi)總RNA，按PrimeScript RT reagent Kit 試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。TRPC1 上游引物序列為5'-GCCAG TTTTGTCACTTTGTTATTT -3'，下游引物序列為5'-C CCATTGTGTTTTTCTTATCCTCA-3';GAPDH 上游引物序列為5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'，下游引物序列為5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3'。PCR 反應(yīng)體系:SYBR? Permix EX TaqTMⅡ(2 ×)12.5 μL、上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。基于內(nèi)部參照GAPDH 做定量分析，采用2－ΔΔCt值比較法進行組織TRPC1 mRNA 的相對定量。

1.4 細胞培養(yǎng)及處理

1.4.1 細胞培養(yǎng):人氣道上皮16HBE 細胞用1640 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、75 μg/mL 青霉素、125 μg/mL鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.4.2 細胞的TRPC1 siRNA 轉(zhuǎn)染:16HBE 細胞以2×105個/孔接種于6 孔板中，24 h 后換為無血清、無雙抗1640 培養(yǎng)基。將100 pmol 的TRPC1 siRNA、100 pmol 的NC siRNA 和10 μL 的Lipofectamine RNAiMAX Reagent 分別加入100 μL 無血清、無雙抗1640 培養(yǎng)液中，室溫下孵育5 min 后，輕輕混勻，室溫下孵育20 min，將混合物分別加入6 孔板中，6 h后更換為含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后進行下一步處理。

1.4.3 細胞免疫熒光檢測細胞轉(zhuǎn)染效率:細胞以1 ×105個/孔接種于預(yù)先放有蓋玻片的24 孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，按照1.4.2 的方法轉(zhuǎn)染細胞。48 h 后去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗20 min，4%多聚甲醛固定30 min。PBS 再次沖洗20 min，以山羊血清封閉30 min 后，兔抗人TRPC1抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜。PBS 清洗20 min，用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗兔二抗于37 ℃下孵育30 min，PBS 再次清洗20 min 后，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育15 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄笤跓晒怙@微鏡觀察、成像，用Imagepro-Plus 軟件進行分析，每張爬片選取4 個視野進行熒光強度測定后取其平均值。

1.4.4 細胞的牽張刺激:16HBE 細胞以4 ×105個/孔接種至膠原包被的硅膠彈性細胞雙向牽拉力6 孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，使用細胞牽張力加載裝置給予細胞刺激。細胞所受壓力大小由培養(yǎng)皿底部彈性膜牽拉應(yīng)變率表示，選用30%牽拉應(yīng)變率。將細胞分為對照組、單純刺激組、刺激+TRPC1 siRNA 轉(zhuǎn)染組。以正弦波牽張，頻率為0.33 Hz。

1.4.5 激光共聚焦檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度:各組細胞刺激6 min 后，立即將培養(yǎng)板內(nèi)細胞消化后制成細胞懸液，D'Hanks 液漂洗2 次，加入5 μmol/L 的Fluo 3-AM，37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min，D'Hanks液再次漂洗2 次。將細胞懸液轉(zhuǎn)移入35 mm×12 mm聚苯乙烯培養(yǎng)皿，置激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。用488 nm 氬離子激光器激發(fā)Fluo 3-AM 的熒光，發(fā)射波長為525～530 nm。用Imagepro-Plus 軟件進行分析，每個視野隨機選4 個細胞進行熒光強度測定后取其均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TRPC1 蛋白在支氣管上皮的表達差異

2.1.1 免疫組化分析TRPC1 蛋白在支氣管上皮的表達差異:TRPC1 陽性染色主要分布于上皮細胞基底面，對照組無明顯染色(圖1)。COPD 組、支氣管哮喘組IA/ area 值明顯高于對照組(P＜0.05)(表1)。

2.1.2 Western blot 分析TRPC1 蛋白在氣道上皮的表達差異:COPD 組、支氣管哮喘組TRPC1/GAPDH蛋白值顯著高于對照組(P＜0.05)(表1)。

2.1.3 qRT-PCR 分析TRPC1 mRNA 在COPD 組、支氣管哮喘組和對照組的表達差異:TRPC1 及GAPDH基因的PCR 產(chǎn)物熔解曲線顯示為單特異性峰，說明沒有引物二聚體及非特異性擴增產(chǎn)物。COPD 組、支氣管哮喘組支氣管上皮內(nèi)TRPC1/GAPDH mRNA顯著高于對照組(P＜0.05)(表1)。

2.2 支氣管上皮細胞內(nèi)TRPC1 受體對機械壓力的敏感性

2.2.1 細胞免疫熒光檢測細胞轉(zhuǎn)染效率:經(jīng)TRPC1 siRNA 轉(zhuǎn)染的細胞其胞內(nèi)TRPC1 含量明顯降低，而NC siRNA 轉(zhuǎn)染組的胞內(nèi)TRPC1 表達水平無明顯差異(圖2A～C)。TRPC1 siRNA 轉(zhuǎn)染組平均熒光強度顯著低于對照組(P＜0.05)，NC siRNA 轉(zhuǎn)染組表達水平與對照組相比無明顯差異(圖2D)。

2.2.2 牽張刺激對細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響:細胞牽張刺激6 min 后，胞內(nèi)鈣離子熒光強度顯著高于對照組(P＜0.05);而刺激+TRPC1 siRNA 轉(zhuǎn)染組鈣離子熒光強度與對照相比無明顯差異(圖3)。

圖1 COPD 組、支氣管哮喘組與對照組氣道上皮TRPC1 蛋白的表達Fig 1 The expression of TRPC1 protein in bronchial epithelium from COPD，asthma and control group

表1 COPD 組、支氣管哮喘組與對照組氣道上皮TRPC1 表達差異Table 1 TRPC1 expression in human bronchial epithelium of subjects from COPD，asthma and control group(±s)

表1 COPD 組、支氣管哮喘組與對照組氣道上皮TRPC1 表達差異Table 1 TRPC1 expression in human bronchial epithelium of subjects from COPD，asthma and control group(±s)

＊P＜0.05 compared with control group.

groupTRPC1 protein(IA/area)TRPC1/GAPDH mRNATRPC1/GAPDH protein control(n=7)0.03 ±0.010.25 ±0.010.36 ±0.01 COPD(n=8)0.14 ±0.02*1.42 ±0.02*1.31 ±0.03*asthma(n=5)0.12 ±0.01*1.52 ±0.02*1.32 ±0.03*

圖2 熒光顯微鏡觀察TRPC1 siRNA 對TRPC1 基因的沉默效率Fig 2 The extent of knockdown in TRPC1 expression after TRPC1 siRNA transfection by fluorescence microscope

圖3 激光共聚焦觀察機械牽張刺激6 min 后細胞內(nèi)鈣離子熒光強度Fig 3 Ca2+ fluorescence intensity after mechanical stretching for 6 min by laser confocal microscopy

3 討論

慢性氣道炎性反應(yīng)疾病氣道重塑的主要病理改變包括上皮下膠原沉積、上皮杯狀細胞化生、氣道平滑肌細胞的增殖和硬度的增加等［7］，造成不可逆的氣流受限，從而形成持續(xù)氣道高壓。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，氣道高壓可促使氣道上皮細胞分泌黏蛋白5AC［1］;壓力刺激可促進氣道上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，而EMT 是氣道纖維化的重要標志［2］;壓力刺激下氣道上皮細胞分泌大量轉(zhuǎn)化生長因子-beta 1(transforming growth factorbeta 1，TGF-beta 1)、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)等炎性因子［3］。

TRP 通道蛋白是細胞膜上的重要受體蛋白，參與機體的多種生理應(yīng)答過程［8］，其亞家族TRPC 包括7 種亞型(TRPC1-TRPC7)，可以被多種炎性因子和膜牽張刺激等激活［9］。在脊柱動物卵泡細胞中發(fā)現(xiàn)TRPC1 是機械敏感離子通道MscCa 的重要成員［4］，而在心肌細胞［5］、血管內(nèi)皮細胞［10］上已證實TRPC1 是一種壓力敏感離子通道。在肺泡上皮細胞上，通過免疫熒光及PCR 技術(shù)曾發(fā)現(xiàn)大量TRPC1表達［6］。本實驗證實了氣道上皮細胞內(nèi)有大量TRPC1蛋白表達，且慢性氣道炎性反應(yīng)疾病患者較正常人明顯增多。

本實驗通過基因沉默技術(shù)明顯降低16HBE 細胞內(nèi)TRPC1 蛋白的表達水平。在壓力刺激作用下，單純刺激組細胞內(nèi)Ca2+濃度顯著高于對照組，而TRPC1 siRNA 轉(zhuǎn)染組無明顯變化?？梢?，TRPC1 是氣道感受壓力的重要受體，且在慢性氣道炎性反應(yīng)疾病患者上皮細胞內(nèi)表達量明顯增加，可能為該類患者氣道高反應(yīng)的機制之一。既往研究發(fā)現(xiàn)TRPM8為氣道感受冷刺激的重要受體［11］，與冷刺激致氣道黏液分泌、炎性因子釋放密切相關(guān)。而TRPC1 與TRPM8 激活后均引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+激活磷脂酶C(phospholipase，PLC)而使磷酯酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2)分解為第二信使三磷酸肌醇(inositol trisphosphate，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DAG)［11-12］，通過以上級聯(lián)反應(yīng)而將物理刺激轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號。因此，針對該信號通路的靶向治療為慢性氣道炎性反應(yīng)疾病的治療提供新思路。

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