Ifi204基因表達對大鼠血管外膜成纖維細胞凋亡和遷移的影響

田茂波，吳 強，宋 方，龍向淑，黃 晶，肖 燕

(1.貴陽醫(yī)學院內(nèi)科學專業(yè);2.貴陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州貴陽550002)

血管外膜成纖維細胞(vascular adventitial fibroblast cell，VAF)是血管外膜的主要細胞成分，當血管受損時細胞被激活，發(fā)生表型改變、增殖、遷移、分泌膠原蛋白，參與血管的修復過程［1］，并獲得α-平滑肌肌動蛋白特征，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞。一部分肌成纖維細胞遷移至內(nèi)膜分泌細胞外基質(zhì)，導致了晚期膠原纖維化并促進管腔狹窄［2-3］。干擾素誘導蛋白P204(P204)是鼠類干擾素誘導蛋白P200 家族成員，可促進多種細胞型的凋亡，抑制細胞遷移［4］。前期研究提示在人VAF 細胞中IFI16(P204 的人類同源性蛋白)存在基礎表達，干擾素-α 可誘導IFI16 大量表達，抑制人VAF 細胞遷移［5］。本研究旨在通過慢病毒介導ifi204 基因的過表達和ifi204 siRNA 沉默，觀察P204 對VAF凋亡和遷移的影響，為血管狹窄性疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級SD 大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量120～150 g，約6 周齡［貴陽醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號SCXK (黔)2012-001］。

細胞培養(yǎng)的DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和青-鏈霉素(Hyclone 公司);胎牛血清(FBS)(Gibco 公司);ifi204 siRNA、control siRNA(Fluorescein Conjugate)-A:sc36869 和抗p204 一抗(Santa 公司);pv-9000 二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中衫金橋公司)X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(Roche 公司);Transwell 小室(Coring 公司);含ifi204 基因的慢病毒顆粒(廣州復能基因有限公司合成);Trizol 總RNA 提取試劑(Life 公司);FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根公司);iTaq Universal SYBR? Green Supermix (Bio-Rad 公司);real-time PCR 擴增引物(上海生工公司合成);抗P53 一抗和抗Vimentin(Abcam 公司);細胞凋亡檢測試劑盒和GAPDH(碧云天公司);通用二抗(Abmart 公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:取3～6 代細胞用于實驗。實驗分為5 組，即含ifi204 基因的慢病毒組(ifi204 lv group)、空載體慢病毒組(blank lv group)、非特異性siRNA 組(control siRNA group)、ifi204 siRNA 轉(zhuǎn)染組和空白對照組(negative group)。

1.2.2 細胞分離、純化、培養(yǎng)及鑒定:采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD 大鼠主動脈原代VAF 細胞，傳代過程中用差速貼壁法去除血管平滑肌細胞來純化VAF［6］。將3～6 代VAF 懸液制備細胞爬片。待細胞增殖匯合度達50%～80%，取出細胞爬片，用4%多聚甲醛固定細胞爬片。用vimentin 抗體對大鼠VAF 作形態(tài)學及免疫化學鑒定。具體方法按pv-9000 二步法免疫組化檢測試劑盒說明書。

1.2.3 基因轉(zhuǎn)染:取對數(shù)增殖期細胞按5 ×104個/孔接種于6 孔板中，用10%正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞匯合度達50%左右，按慢病毒轉(zhuǎn)染說明書操作，分別干預72 h 后收集細胞。另外取同一批細胞接種于6 孔板中，0.8 ×105個/孔，用不含雙抗的10%DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察待細胞達50%左右匯合度時進行siRNA 轉(zhuǎn)染，按X-tremeGENE siRNA Transfection Reagen 說明書進行轉(zhuǎn)染，以非特異性siRNA(control siRNA)陰性對照組、ifi204 siRNA 實驗組分別干預6 h，換液48 h，收集細胞，空白對照細胞不做任何處理。

1.2.4 細胞劃痕法和Transwell 法測細胞遷移:1)細胞劃痕法:在6 孔板背后均勻畫出6 條橫穿過孔的線條，待孔內(nèi)空白組、control siRNA 組、ifi204 siRNA 組、ifi204 基因慢病毒組、空載慢病毒組細胞匯合度達90%以上后，用劃線工具垂直于孔背面橫線劃痕。吸棄孔內(nèi)液體，并用PBS 液清洗2 遍，加入低血清培養(yǎng)基。顯微鏡下拍照后放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h 后取樣，拍照。計算遷移距離，遷移距離=劃痕0 h 后劃痕寬度－劃痕24 h 后劃痕寬度，以像素(px)作為長度單位。2)Transwell法:消化細胞計數(shù)后，用無血清DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞至1×106個/L。每個小室(上室)中加入100 μL上述細胞懸液，在24 孔板內(nèi)(下室)加入含5 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基600 μL，將24 孔板置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h 后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，上室用PBS 液洗滌3 遍后，將小室置于4%多聚甲醛中固定20 min，隨后將其置于超凈臺中自然晾干。再將小室置于0.1%結晶紫中染色20 min，畢后用PBS 液洗滌5 遍。晾干后，顯微鏡下隨機選取4 個視野，觀察細胞并計數(shù)。

1.2.5 Real-time PCR 檢測mRNA 表達:按Trizol 總RNA 提取試劑盒說明提取總RNA，取1 μg 按試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取2 μL 進行real-time PCR，ifi204 基因上游引物:5'-AAGAAGCCACAGCC AAGTGT-3'，下游引物:5'-CCTCTGGGAATGTTCTG GTT-3'，擴增片段長度200 bp;P53 上游引物:5'-GCTGAGTATCTGGACGACAGG-3 '，下游引物:5'-A GCGTGATGGTAAGGATG-3'，擴增片段長度253 bp;GAPDH 上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '，下游引物:5'-TCCACCCTGTTGCTGTA-3'，擴增片段長度452 bp。PCR 反應條件為:預變性95 ℃10 min、變性95 ℃15 s、延長60 ℃1 min，經(jīng)41 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參照，2－ΔΔCt法計算各組P204、P53 mRNA 的相對表達量。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達:提取經(jīng)上述方法干預的細胞總蛋白，BCA 定量，每樣品孔加蛋白30 μg，進行SDS-PAGE，濕法轉(zhuǎn)印蛋白條帶至PVDF 膜。將膜用Western blot 封閉液封閉過夜，次日取出TBST 洗5 min ×3 次，加稀釋好的一抗(1∶500)孵育2～4 h，TBST 搖床漂洗5 min ×3 次后，與通用型二抗于室溫下?lián)u床孵育2 h，再用TBST 搖床漂洗5 min ×5 次，最后加入混合的ECL發(fā)光劑，保鮮膜固定PVDF 膜。X 線片顯影、定影、沖洗后對膠片掃描，最后用相關圖像軟件對目的蛋白/內(nèi)參的吸光度比值的均數(shù)±標準差(±s)來表示。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡:收集經(jīng)上述處理的5 組細胞，制成細胞懸液。碘化丙啶染色液按說明書配制。每管加入0.5 mL 碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。染色完成后當日內(nèi)行流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 細胞形態(tài)及鑒定

原代培養(yǎng)的大鼠VAF 細胞貼壁后呈長梭形生長，部分交織呈網(wǎng)狀(圖1A)。大鼠VAF 經(jīng)vimentin蛋白免疫印跡，陽性胞質(zhì)棕黃色，陽性率95%以上(圖1B)，陰性對照見非特異性著色(圖1C)。

2.2 慢病毒介導攜帶綠色熒光ifi204 基因轉(zhuǎn)染效率

按慢病毒操作手冊轉(zhuǎn)染大鼠VAF 細胞，72 h 后在熒光顯微鏡下可見80%左右大鼠VAF 細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光(圖2)。

2.3 細胞遷移變化

圖1 VAF 形態(tài)及鑒定結果Fig 1 Cell morphology and identification(×100)

細胞劃痕24 h 后計算遷移距離，與blank lv 組、control siRNA 組、ifi204 siRNA 組或negative 組比較，ifi204 lv 組的遷移距離較短(P＜0.05);與control siRNA 組、negative 組和blank lv 組比較，ifi204 siRNA組遷移距離延長(P＜0.05);通過Transwell小室計算遷移細胞，與blank lv 組、control siRNA 組、ifi204 siRNA 組或negative 組比較，ifi204 lv 組的遷移細胞較少(P＜0.05);與control siRNA 組、negative 組或blank lv 組比較，ifi204 siRNA 組遷移細胞較多(P＜0.05)(圖3，4)。

圖2 慢病毒介導攜帶綠色熒光ifi204 基因轉(zhuǎn)染效率Fig 2 Translation efficient of ifi204 gene with GFP was mediated by lentivirus(×100)

圖3 干預對VAF 遷移距離和數(shù)量的影響Fig 3 Effect of intervention on migration distance and number of rat VAF(×100)

2.4 Real-time PCR 結果

ifi204 lv 組P204 mRNA 過表達，同時促進P53 mRNA 表達;ifi204 siRNA 組P204 mRNA 沉默，亦抑制P53 mRNA 表達。與blank lv 組、control siRNA 組、ifi204 siRNA 組或negative 組比較，ifi204 lv 組P204、P53 mRNA 表達上調(diào)(P＜0.05);與control siRNA 組、negative 組或blank lv 組比較，ifi204 siRNA 組P204、P53 mRNA 表達下調(diào)(P＜0.05)(圖5)。

圖4 干預對VAF 遷移距離和數(shù)量的影響Fig 4 Effect of intervention on migration distance(pix)and number of rat VAF(±s，n=4)

圖5 干預對各組P204/P53 mRNA 表達的影響Fig 5 Effect of intervention on expression of P204/P53 mRNA of rat VAF(±s，n=4)

2.5 Western blot 結果

ifi204 lv 組P204 蛋白過表達，同時促進P53 蛋白表達;ifi204 siRNA 組P204 蛋白沉默，亦抑制P53蛋白表達。與blank lv 組、control siRNA 組、ifi204 siRNA 組或negative 組比較，ifi204 lv 組P204、P53蛋白表達上調(diào)(P＜0.05);與control siRNA 組、negative 組或blank lv 組比較，ifi204 siRNA 組P204、P53蛋白表達下調(diào)(P＜0.05)(圖6)。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡的結果

與blank lv 組、control siRNA 組、ifi204 siRNA 組或negative 組比較，ifi204 lv 組晚期凋亡百分比增加(P＜0.05);與control siRNA 組、negative 組或blank lv 組比較，ifi204 siRNA 晚期凋亡百分比減少 (P＜0.05)。與control siRNA 組或negative 組比較，blank lv 組晚期凋亡百分比增加(P＜0.05)(圖7)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)血管重構是血管增殖性疾病及相關治療術后再狹窄的主要病理生理機制。以前的研究忽視了血管外膜改變在血管重構中的作用［7］。近年的研究結果指出VAF 在血管重構中并非僅起支持及營養(yǎng)作用。在血管損傷后，位于血管外膜的VAF由“靜止”狀態(tài)轉(zhuǎn)為“激活”狀態(tài)，遷移至內(nèi)膜下參與新生內(nèi)膜形成［8］。因此，將VAFs 作為治療靶點，有效地抑制其遷移、促進凋亡對防治血管增殖性疾病有重要意義。

圖6 干預對P204 和P53 蛋白在大鼠VAF 中的影響Fig 6 Effect of intervention on expression of P204/P53 protein of rat VAF(±s，n=4)

干擾素誘導蛋白P204(interferon-inducible protein 204，P204)是鼠類干擾素(interferon，INF)誘導蛋白P200 家族的鼠類蛋白成員，P204 可通過多種機制促進多種細胞的凋亡及抑制細胞遷移［4］。P204 通過其200 X 的MF/LHATVAT/S 模序介導和53BP1 的結合從而激活P53，抑制腫瘤細胞遷移［9］。細胞凋亡是細胞受到外界因素刺激時，經(jīng)過復雜而嚴格的信號通路促進了細胞程序化死亡，它具有典型的caspase 依賴性，通常caspase 在被活化后，調(diào)節(jié)結構域被切除，形成異聚體蛋白酶，后者再裂解細胞周期蛋白如Rb、P21，使細胞周期得以繼續(xù)，在其他因素下，促進受損細胞凋亡。

圖7 流式細胞術分析干預對大鼠VAF 晚期細胞凋亡的影響Fig 7 Effect of intervention on late apoptosis of rat VAF by flow cytometry(±s，n=4)

前期研究提示P204 蛋白在大鼠血管外膜及培養(yǎng)的主動脈原代VAF 細胞均存在結構性表達［10］。本研究通過轉(zhuǎn)染特異性ifi204 基因來觀察該基因?qū)毎飳W功能的影響，結果顯示在P204 過表達組中，P204 表達上調(diào)與正常組差異無成倍數(shù)增加(可能與P204 在VAF 細胞基礎表達較多有關)，細胞凋亡率上調(diào)，細胞遷移速度降低;在沉默組中，P204 的表達下調(diào)，細胞活力提高，細胞凋亡減少，細胞遷移速度加快。提示P204 蛋白過表達不僅可以促進大鼠VAF 細胞凋亡，而且可以抑制細胞遷移。與control siRNA 組或negative 組比較，blank lv 組晚期凋亡百分比增加，可能是慢病毒外源性介入對該細胞的影響，具體機制和原因有待研究。另外發(fā)現(xiàn)，P53 和P204 mRNA 或蛋白的表達變化呈一致性趨勢，提示P53 參與了P204 介導的細胞凋亡和遷移。結合本研究結果認為，在VAF 中，P204 通過活化P53 使其表達上調(diào)是抑制VAF 遷移及促進其凋亡的機制之一，至于P204 介導VAF 遷移和凋亡是否還有其他路徑和機制有待進一步研究。

綜上所述，P204 在鼠VAF 中存在基礎表達，具有抑制VAF 遷移，促進其凋亡的生物學效應，P53 可能同時參與了該效應的調(diào)控過程。

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