子癇前期患者血清微小RNAs的差異表達(dá)研究

厲 倩,龍安雄,姜連生,蔡雷鳴,謝 驪,顧繼安,譚龍益

(上海市第一人民醫(yī)院寶山分院檢驗(yàn)科 200940)

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·論 著·

子癇前期患者血清微小RNAs的差異表達(dá)研究

厲 倩,龍安雄,姜連生,蔡雷鳴,謝 驪,顧繼安,譚龍益△

(上海市第一人民醫(yī)院寶山分院檢驗(yàn)科 200940)

目的 探討子癇前期患者血清微小RNAs(miRNAs)不同的表達(dá)水平，分析子癇前期相關(guān)標(biāo)志物。方法 選擇10個(gè)子癇前期患者胎盤中差異表達(dá)的miRNA，分別收集該院30例子癇前期患者和30例正常妊娠孕婦孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血清miRNAs，采用SYBR Green qRT-PCR法檢測(cè)血清中10個(gè)miRNAs的表達(dá)量。結(jié)果 子癇前期胎盤中高表達(dá)的3個(gè)miRNAs(miR-152、miR-183、miR-210)在子癇前期孕中、晚期血清中表達(dá)顯著升高，而胎盤中高表達(dá)的miR-182僅在子癇前期孕晚期表達(dá)顯著升高；子癇前期胎盤中低表達(dá)的6個(gè)miRNAs(miR-1、miR-328、miR-363、miR-377、miR-500、miR-584)在子癇前期各個(gè)孕期的表達(dá)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 miR-152、miR-183、miR-210在子癇前期孕中、晚期血清中表達(dá)顯著升高，可能是預(yù)測(cè)子癇前期發(fā)生的良好生物標(biāo)志物。

子癇前期； miRNAs； 血清; 生物標(biāo)志物

子癇前期(PE)是一種常見的孕婦多系統(tǒng)紊亂綜合征，是孕婦和胎兒發(fā)病率(5%)和病死率最高的疾病之一，全球每年大約800萬人受到影響，7萬孕婦病死[1]。其主要表現(xiàn)為在懷孕20周后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿，部分患者出現(xiàn)水腫、頭痛，嚴(yán)重者發(fā)生子癇、肝腎功能和凝血障礙，成人呼吸窘迫綜合征和胎兒發(fā)育障礙等，發(fā)生過子癇的孕婦其后患高血壓、心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)概率也增加。胎兒分娩和胎盤剝離是目前唯一的治療手段，但早期對(duì)高危孕婦進(jìn)行干預(yù)，可減少子癇的發(fā)生及減輕危害，具有一定的臨床價(jià)值。

子癇前期的病因和病理學(xué)機(jī)制尚不清楚，且缺乏較理想的早期診斷指標(biāo)[2]。有研究報(bào)道在子癇前期胎盤中發(fā)現(xiàn)了異常表達(dá)的微小RNAs(miRNAs，miRNAs)，這為該研究開辟了一個(gè)新方向[3]。目前的相關(guān)研究表明miRNAs與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與子癇前期有關(guān)的差異表達(dá)miRNAs，但多數(shù)都是在胎盤中進(jìn)行檢測(cè)[3-5]?，F(xiàn)通過檢測(cè)子癇前期患者不同孕周外周血miRNAs，分析某變化規(guī)律，探討miRNAs作為子癇前期預(yù)測(cè)因子的臨床價(jià)值。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年1月至2013年12月該院分娩的30例PE患者(病例組)和30例正常妊娠產(chǎn)婦(對(duì)照組)。PE診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)婦產(chǎn)科學(xué)(第7版)[3]，即妊娠20周后收縮壓大于或等于140 mm Hg和(或)舒張壓大于或等于90 mm Hg，伴蛋白尿大于或等于0.3 g/24 h，或隨機(jī)蛋白尿陽(yáng)性。所有研究對(duì)象都是單胎妊娠，對(duì)照組和病例組的年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。收集對(duì)照組孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血清30例，收集病例組孕早期血清14例、孕中期30例、孕晚期30例。見表1。

表1 2組研究對(duì)象臨床資料結(jié)果比較

1.2 樣本采集、處理及保存 采用分離膠真空采血管采集空腹血樣3～5 mL，靜置20 min后離心，1 200 r/min，離心10 min。首次離心后收集上清液并高速(12 000 r/min)離心10 min，置上清液于無RNA酶的無菌Eppendorf管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA抽提 使用miRNeasy Serum/Plasma kit(德國(guó)Qiagen公司)提取血清總RNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作：200 μL血清加入1 mL Qiazol溶解液，充分混勻，室溫放置5 min，加入3.5 μL的Cel miR-39(1.6～108/μL,Qiagen)作為RNA抽提質(zhì)量指標(biāo)，然后加入200 μL的氯仿，充分混勻，室溫放置3 min,后置于低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)內(nèi)12 000 r/min離心15 min，將550 μL上層澄清萃取液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL無菌Eppendorf管中，加入1.5倍(825 μL)的無水乙醇，充分混勻，分2次將混合液過洗脫柱，棄去濾過液，洗脫柱分別用700 μL RWT、RPE緩沖液和80%乙醇溶液洗滌，末次洗滌后洗脫柱高速(12 000 r/min)離心5 min以干燥柱內(nèi)膜，最后加入14 μL無RNA酶水洗脫總RNA。

1.4 cDNA第1鏈合成 應(yīng)用miScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen)合成cDNA第1鏈(加尾法)，操作步驟：150 μL PCR反應(yīng)管中加入2 μL 10×RT mix，2 μL 10×nucleics mix，8 μL無RNA酶水，4 μL 5×hispec Buffer和4 μL總RNA，充分混勻并低速(1 200 r/min)離心1 min后置于擴(kuò)增儀(Bioer)中，36 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。

1.5 熒光定量PCR 采用miScirpt SYBR green PCR 試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)和ABI 7500擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量。反應(yīng)體系：10 μL 2×master mix，2 μL 10×通用引物，2 μL 10×特異性引物，4 μL 無RNA酶水和2 μL 100倍稀釋的cDNA模板。擴(kuò)增條件：95 ℃變性15 min，循環(huán)條件94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 34 s，延伸階段采集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)檠逯蟹€(wěn)定存在的miR-16。目標(biāo)miRNA，miR-16和Cel miR-39分別在不同的反應(yīng)孔中進(jìn)行擴(kuò)增。所有熒光定量PCR反應(yīng)在96孔反應(yīng)板內(nèi)進(jìn)行。使用SDS1.3(Applied Biosystems)軟件分析Ct值，每個(gè)標(biāo)本都做3個(gè)平行復(fù)孔，取Ct平均值。將目標(biāo)miRNAs的平均Ct值減去內(nèi)參miR-16 Ct值作為ΔCt值，ΔCt值越低，則表達(dá)水平越高，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化后的2-ΔΔCt值表示miRNA的組間表達(dá)倍數(shù)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間兩兩比較使用Student′st檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血清 miRNAs的檢測(cè)結(jié)果比較 各組血清中均能檢測(cè)到Cel miR-39、miR-16及 10種目標(biāo)miRNAs，其中Cel miR-39在各組中的含量非常穩(wěn)定，說明實(shí)驗(yàn)中的RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增條件控制較好，miR-16在各組的表達(dá)量穩(wěn)定，表明miR-16可作為內(nèi)參基因。見表2。

2.2 血清中10種miRNAs在不同孕期的表達(dá)量比較 與正常妊娠同孕期比較，PE患者孕早期(12～14周)血清中10種miRNAs的表達(dá)量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PE患者孕中期(20～24周)miR-152、miR-183、miR-210的表達(dá)量升高，PE患者孕晚期(28～32周)miR-152、miR-182、miR-183、miR-210的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 血清中12種miRNAs的檢測(cè)結(jié)果比較

表3 血清中10種miRNAs的表達(dá)量結(jié)果比較

2.3 PE患者妊娠中、晚期miR-152、miR-182、miR-183、miR-210與正常妊娠表達(dá)倍數(shù)變化 miR-152、miR-183、miR-210在妊娠中期PE患者血清中的表達(dá)分別為正常妊娠的5.28、12.99、11.1倍，而miR-182在妊娠晚期PE患者血清中的表達(dá)為正常妊娠的3.73倍。見表4。

表4 2組研究對(duì)象表達(dá)升高的miRNAs的倍數(shù)值 (相對(duì)倍數(shù)變化，2-ΔΔCt)

3 討 論

miRNAs是一類全長(zhǎng)為19～25個(gè)核糖核苷酸的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA,由一段具有發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體剪切后生成,通過與目標(biāo)mRNA分子的3′端非編碼區(qū)域(3′UTR)互補(bǔ)配對(duì)使目標(biāo)mRNA分子的翻譯受到抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控[6]。生物信息分析顯示，只占人類基因組1%～3%的miRNA調(diào)控著高達(dá)30%的人類基因。近年來的研究表明miRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡，腫瘤形成，心血管疾病等生理和病理過程中都起非常重要的作用。

miRNAs不僅存在于組織細(xì)胞中，在血漿或血清中也非常穩(wěn)定，這為miRNAs進(jìn)行臨床疾病研究提供了依據(jù)[7]。Gilad等[7]發(fā)現(xiàn)采用qRT-PCR技術(shù)可對(duì)人體的尿液、唾液、羊水及胸水miRNAs進(jìn)行定量，這些體液中的miRNAs表達(dá)異?？赡茴A(yù)示機(jī)體功能的改變。已有多項(xiàng)研究顯示血清miRNAs表達(dá)譜與多種腫瘤相關(guān)，可能在腫瘤的診斷及預(yù)后判斷方面具有重要價(jià)值。

目前多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道PE胎盤中異常表達(dá)的miRNAs，有關(guān)血清miRNAs表達(dá)譜與子癇前期的關(guān)系尚未明確。本組通過分析2001～2011年P(guān)ubMed數(shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)，確定10個(gè)在2個(gè)或2個(gè)以上研究中均表明在胎盤組織中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的miRNAs，其中表達(dá)上調(diào)的是miR-210、miR-182、miR-183、miR-152，表達(dá)下調(diào)的是miR-1、miR-328、miR-363、miR-377、miR-500、miR-584，使用SYBR Green qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)PE患者不同孕期血清中10個(gè)miRNAs的表達(dá)水平。

與胎盤中的miRNAs研究結(jié)果相一致[3-5]。PE患者孕晚期血清中miR-210、miR-182、miR-183、miR-152的表達(dá)均高于正常妊娠者，其中miR-210、miR-183、miR-152在孕中期即已經(jīng)高于正常妊娠者，提示孕中期miR-210、miR-182、miR-152可作為PE的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子。PE患者血清中miR-210表達(dá)升高已有報(bào)道[8]。而miR-182、miR-183、miR-152在PE患者血清中表達(dá)升高尚未見相關(guān)報(bào)道。胎盤中升高的miRNAs可能通過外排體(exosome)的形式分泌到血液中，進(jìn)而影響到血清、血漿miRNA表達(dá)譜。

與正常妊娠者比較，miR-1、miR-328、miR-363、miR-377、miR-500、miR-584在胎盤研究中表達(dá)下調(diào)的miRNAs，在PE患者血清中的表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能是受到了其他目前未知的干擾因素影響，因?yàn)檫@些miRNAs不是胎盤的特異性，其他組織、細(xì)胞也可能分泌。Yang 等[9]應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)比較了2例PE重度、2例PE輕度和1例正常妊娠孕婦在分娩前血清miRNAs表達(dá)譜，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)3個(gè)與其他胎盤miRNAs表達(dá)譜研究報(bào)道一致的結(jié)果，這可能是因?yàn)檠迨艿狡渌喔蓴_因素的影響，胎盤與血清中的結(jié)果并不總是正相關(guān)。胎盤特異性miRNAs由于只在胎盤組織表達(dá)，其在胎盤組織和外周血中的相關(guān)性可能會(huì)更好，這可能是未來外周血PE相關(guān)miRNAs的研究熱點(diǎn)[10-11]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，PE患者孕中期miR-210、miR-183、miR-152表達(dá)升高，并維持至孕晚期，miR-182在PE孕晚期表達(dá)升高，提示miR-210、miR-183、miR-152可能是預(yù)測(cè)子癇前期發(fā)生的良好生物標(biāo)志物。

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Study on the differential expression of microRNAs in the preeclampsia serum*

LIQian,LONGAn-xiong,JIANGLian-sheng,CAILei-ming,XIELi,GUJi′an,TANLong-yi△

(DepartmentofClinicalLaboratory,BaoshanBranchofShanghaiFirstPeople′sHospital,Shanghai200940,China)

Objective To study the differential expression of serum microRNAs in preeclampsia(PE) patients so as to find some serum biomarkers related to PE.Methods Ten microRNAs were selected according to their reported differential expression in PE placenta.30 PE patients and 30 normal pregnacy were recruited in the study.The expression of these 10 microRNAs in serum from the differnt trimesters were determined by SYBR Green quantitive reverse transcription-PCR(qRT-PCR).Results Compared with control,the expression of miR-152,miR-183,miR-210 were higher in both second and third trimester,the expression of miR-182 was only higher in third trimester.While the expression of 6 miRNAs were downregulated in PE plancenta,namely miR-1,miR-328,miR-363,miR-377,miR-500,miR-584,showed no significant difference between PE patients and normal pregnacy throughout the three trimesters.Conclusion The expression of serum miR-152,miR-183,miR-210 elevated since the second trimester,indicating their potential role as serum biomarkers for forcasting PE.

preeclampsia； microRNA； serum； biomarker

上海市寶山區(qū)科委科研項(xiàng)目(11-E-15)。

厲倩，女，碩士，主管技師，主要從事妊娠相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷研究?！?/p>

，E-mail:sybspyl163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.013

A

1672-9455(2015)12-1692-03

2014-12-22

2015-02-18)