國產(chǎn)和進(jìn)口熒光定量PCR試劑檢測HBV-DNA的比對分析*

張 玥，田文君，劉義慶，張炳昌，張 慶，渠 滕，劉春梅

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250021)

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·論 著·

國產(chǎn)和進(jìn)口熒光定量PCR試劑檢測HBV-DNA的比對分析*

張 玥，田文君，劉義慶，張炳昌，張 慶，渠 滕，劉春梅△

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250021)

目的 分析國產(chǎn)和進(jìn)口實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑檢測乙型肝炎病毒(HBV)-DNA的相關(guān)性，探討國產(chǎn)和進(jìn)口試劑在臨床應(yīng)用中的差異。方法 使用國產(chǎn)和進(jìn)口試劑平行檢測262例乙型肝炎(乙肝)患者血漿當(dāng)中的HBV-DNA水平，國產(chǎn)試劑采用手工提取標(biāo)本，羅氏LightCycler480 Ⅱ(LC480 Ⅱ)進(jìn)行核酸擴(kuò)增；進(jìn)口試劑則采用羅氏COBAS AmpliPrep(CAP)和COBAS Taqman48(CTM)進(jìn)行標(biāo)本提取和擴(kuò)增；對HBV-DNA病毒載量數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換(log10)，并將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果 國產(chǎn)和進(jìn)口試劑檢測結(jié)果，經(jīng)線性擬合，R2=0.814 3。HBV-DNA濃度在10～103IU/mL的標(biāo)本，R2=0.300 6；濃度在104～105IU/mL的標(biāo)本，R2=0.411 8；濃度在106～108IU/mL的標(biāo)本，R2=0.801 7。進(jìn)口試劑陽性檢出率為75.57%(198/262)，明顯高于國產(chǎn)試劑陽性檢出率[65.65%(172/262)]。結(jié)論 國產(chǎn)試劑和進(jìn)口試劑相比，相關(guān)性良好。HBV-DNA濃度在106～108IU/mL時，相關(guān)性最高；濃度在104～105IU/mL時，相關(guān)性一般；濃度在10～103IU/mL時相關(guān)性較差，國產(chǎn)試劑與進(jìn)口試劑有明顯差異，靈敏度有待進(jìn)一步提高。

乙型肝炎病毒DNA； 實(shí)時熒光定量PCR； 試劑比對； 血漿

乙型肝炎(簡稱乙肝)是世界常見的傳染病之一[1]，全球感染乙肝的人群約有3.5億[2]，中國大約1.2億人，占三分之一[3]，占我國人口總數(shù)的8%～10%，是感染乙型肝炎病毒(HBV)人數(shù)最多的國家。HBV是屬于嗜肝DNA病毒科，有較強(qiáng)的抵抗性、傳染性和變異性，并且傳播途徑多樣。乙肝極易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，從而引發(fā)肝癌[3]，所以預(yù)防和治療乙肝已成為中國乃至全球尤為重要的研究課題之一?，F(xiàn)今，在臨床眾多檢測HBV感染的方法中，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測乙肝病毒核酸(HBV-DNA)是目前特異性較好、靈敏度較高的方法[4]，HBV-DNA復(fù)制越高，傳染性就越強(qiáng)。同時，結(jié)合乙肝五項(xiàng)[5]、肝功能和甲胎蛋白(AFP)等項(xiàng)目的測定，可以更好地反映出乙肝患者的病情和用藥治療情況，從而為臨床醫(yī)生對患者進(jìn)行診斷和治療提供可靠的理論依據(jù)。本文就收集的262例乙肝患者血液標(biāo)本，采用兩種不同的試劑進(jìn)行檢測并統(tǒng)計(jì)分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年7月至2014年1月的期間在本院就診做超敏乙肝病毒DNA(HS-HBV-DNA)檢測時的乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血標(biāo)本262例。將標(biāo)本按3 000 r/min離心8 min，留取血漿冷凍于-80 ℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑 試劑A由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供；試劑B由羅氏診斷產(chǎn)品有限公司提供。試劑A、B分別用羅氏LC480 Ⅱ擴(kuò)增儀和羅氏CAPCTM檢測系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)所用試劑在有效期內(nèi)，儀器均已進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.3 方法 將262例血漿標(biāo)本分別用試劑A、B進(jìn)行平行檢測，試劑A采用人工提取核酸和實(shí)時熒光定量檢測技術(shù)，最低檢出限為5×102IU/mL，定量檢測線性范圍為(1×103)～(5×107)IU/mL；試劑B基于羅氏CAP提取儀標(biāo)本制備過程和同時進(jìn)行的靶DNA PCR擴(kuò)增與靶序列特異性雙標(biāo)記寡核苷探針檢測過程，最低檢出限為12×10 IU/mL，定量檢測線性范圍為(5.45×10)～(1×108)IU/mL。

1.3.1 試劑A 離心管中加人100 μL待測血漿標(biāo)本和100 μL的DNA提取液1，充分振蕩混勻，13 000 r/min離心10 min；吸棄上清液；加入25 μL DNA提取液2，振蕩混勻，完全將沉淀溶解，3 000 r/min離心10 s，然后100 ℃干浴10 min；13 000 r/min離心10 min，離心完畢后，取2 μL上清液加入PCR管內(nèi)的反應(yīng)液中。

1.3.2 試劑B 取待測血漿標(biāo)本1 030 μL，加入帶條碼夾的樣品管中，與配套專用試劑盒裝入羅氏CAP提取儀內(nèi)。

1.3.3 質(zhì)量控制 試劑A每批次做陰性對照、空白對照及高中低三個不同水平的質(zhì)控品；試劑B每批次均做陰性對照及一個低水平的質(zhì)控品。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 首先對HBV-DNA病毒載量數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換(log10)，采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試劑比對用線性分析和χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種試劑檢測結(jié)果相關(guān)分析 將試劑A、B的檢測結(jié)果取對數(shù)值后做相關(guān)分析，通過分析曲線可以看出，線性良好，試劑A、B契合度一般，R2=0.814 3，線性曲線如表1所示。

表1 兩種試劑檢測結(jié)果相關(guān)分析

2.2 兩種試劑檢測率比較 試劑B陽性檢出率為75.57%(198/262)，試劑A陽性檢出率為65.65%(172/262)，經(jīng)檢驗(yàn)，進(jìn)口試劑陽性檢出率明顯高于國產(chǎn)試劑(χ2=20.833，P<0.01)，結(jié)果詳見表2。

表2 兩種試劑檢測率比較(n)

3 討 論

HBV-DNA定量可以精準(zhǔn)地反映患者體內(nèi)的病毒復(fù)制情況，目前檢測HBV-DNA定量的方法和試劑種類繁多，國際公認(rèn)進(jìn)口羅氏試劑為檢測HBV-DNA定量的參比試劑[6]。進(jìn)口試劑靈敏度高、精密度好，但試劑成本較高，儀器價(jià)格昂貴，檢測時間長，需要患者血漿量大，在大部分醫(yī)院難以廣泛使用。國產(chǎn)試劑基本為開放試劑，價(jià)格適中，檢測快速，重復(fù)性較好，醫(yī)院因?yàn)榭剖野l(fā)展和經(jīng)濟(jì)水平等原因，使用國產(chǎn)試劑的單位比較普遍[7]。試劑A為煮沸法，手工提取核酸繁瑣復(fù)雜，極易造成核酸的丟失，容易將檢出限附近的低濃度標(biāo)本漏檢[8]；試劑B采用磁珠分離技術(shù)，標(biāo)本處理在羅氏CPA提取儀內(nèi)進(jìn)行，降低了因操作不當(dāng)?shù)仍虍a(chǎn)生的假陽性，且每個標(biāo)本中加入內(nèi)標(biāo)來防止假陰性，監(jiān)測整個提取和擴(kuò)增過程，試劑前期準(zhǔn)備也簡單、便捷。

本組結(jié)果分析可以看出，兩種試劑線性相關(guān)性良好，R2=0.814 3。HBV-DNA濃度在106～108IU/mL時，相關(guān)性最高；濃度在104～105IU/mL時，相關(guān)性一般；濃度在10～103IU/mL時相關(guān)性較差，較進(jìn)口試劑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，靈敏度有待進(jìn)一步提高。在262例標(biāo)本檢測結(jié)果中，有28例經(jīng)試劑A檢測陰性而試劑B檢測陽性，提示試劑B的靈敏度更高；有2例標(biāo)本，試劑A檢測陽性而試劑B檢測陰性，說明在用試劑A提取過程存在污染的可能。兩種試劑提取方法和對標(biāo)本體積的需求量不同，所以試劑的靈敏度、精密度和操作過程等也不同。在262例標(biāo)本當(dāng)中，其中4例標(biāo)本濃度大于5×107IU/mL，用羅氏CAPCTM檢測系統(tǒng)第一次上機(jī)實(shí)驗(yàn)未得出數(shù)據(jù)，經(jīng)10倍稀釋得出結(jié)果。用試劑A做4例標(biāo)本，不用稀釋便可得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用試劑B做濃度大于5×107IU/mL的標(biāo)本時，必須稀釋。所以，在乙肝活動期或明確高濃度標(biāo)本時，可以直接選擇試劑A來檢測HBV-DNA水平。

現(xiàn)在臨床治療乙肝以核苷類抗病毒藥物為主，在長期的治療過程當(dāng)中，極易發(fā)生HBV的變異和耐藥[9]。HBV變異和耐藥的發(fā)生，不僅使患者治療費(fèi)用增加，如不及時發(fā)現(xiàn)，甚至?xí)M(jìn)一步惡化，使病情加重，影響后續(xù)治療藥物的選擇。實(shí)時、準(zhǔn)確地監(jiān)測乙肝患者HBV-DNA的水平，不僅是臨床醫(yī)生用藥的關(guān)鍵性指標(biāo)，也是患者了解病情的直觀數(shù)據(jù)[10]。雖然進(jìn)口試劑價(jià)格較貴，但是靈敏度相比較高，可以在用藥治療后，進(jìn)行隨訪檢測，觀察是否到達(dá)預(yù)期治療效果。國產(chǎn)試劑在中、高濃度范圍內(nèi)，相關(guān)性良好，患者在初診、乙肝活動期或HBV反跳時進(jìn)行檢測，不僅減少了患者看病時間和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可以提高患者和醫(yī)生對臨床實(shí)驗(yàn)室的滿意度。

綜上所述，2種實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑，標(biāo)本HBV-DNA濃度在10～103IU/mL時，國產(chǎn)試劑與進(jìn)口試劑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)口試劑靈敏度較高，適用于乙肝患者耐藥后選擇新藥治療的療效評估和患者治療后期的病情監(jiān)測。乙肝活動期或做高濃度標(biāo)本時，可以直接選擇試劑A。臨床醫(yī)生可根據(jù)患者的具體病情，選擇適合的檢測試劑。

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Comparative analysis on domestic and imported fluorescent quantitative PCR reagents for detecting HBV-DNA*

ZHANGYue,TIANWen-jun,LIUYi-qing,ZHANGBing-chang，ZHANGQing,QUTeng,LIUChun-mei△

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedShandongProvincialHospital,ShandongUniversity,Jinan,Shandong250021,China)

Objective To analyze the correlation between the domestic and imported real-time fluorescent quantitative PCR reagents for detecting HBV-DNA and to explore their difference in clinical application.Methods The domestic and imported reagents were used to parallelly detect the plasma HBV-DNA content in 262 cases of hepatitis B.The domestic reagent adopted the sample extracting by adopting the manual method and the amplification for nucleic acid was performed by the Roche LightCycler480 Ⅱ(LC480 Ⅱ);the imported reagent used the Roche COBAS AmpliPrep (CAP) and COBAS Taqman48(CTM) for conducting the sample extracting and amplification;the HBV DNA viral load data (log10) was performed the logarithmic transformation and the 2 sets of data were conducted the correlation analysis.Results The detection results of the domestic and imported reagents were performed the linear fitting,R2=0.814 3.The sample with the concentration range of 10-103IU/mL,R2= 0.300 6;the sample with the concentration range of 104-105IU/mL,R2= 0.411 8;the sample with the concentration range of 106-108IU/mL,R2=0.801 7.The positive detection rate of the imported reagent was 75.57% (198/262),which was significantly higher than 65.65% (172/262) of the domestic reagent.Conclusion There is a good correlation between the domestic reagent and imported reagent.The correlation is the highest when the HBV-DNA concentration in the range of 106-108IU/mL;the correlation is general when the concentration in the range of 104-105IU/mL;the correlation is lowest when the concentration in the range of 10-103IU/mL,there is a significant difference between the domestic reagent and imported reagent and the sensitivity of the domestic reagent remains to be further improved.

HBV-DNA; real-time fluorescent quantitation PCR; reagent comparison; plasma

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81102220)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2011HM019)； 山東省臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目(魯衛(wèi)醫(yī)字[2013]26號)。

張玥，女，技師，本科，主要從事肝病的分子診斷工作。△

，E-mail：lcm831011@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.002

A

1672-9455(2015)02-0147-02

2014-05-07

2014-08-28)