羅氏LightCycler Nano熒光定量PCR儀性能評(píng)價(jià)*

張 宇，李 冬，戴 燕，鄭為超，萬(wàn)海英△

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200065；2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232001)

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·論 著·

羅氏LightCycler Nano熒光定量PCR儀性能評(píng)價(jià)*

張 宇1，李 冬1，戴 燕1，鄭為超2，萬(wàn)海英1△

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200065；2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232001)

目的 對(duì)美國(guó)羅氏公司LightCycler Nano 32孔熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀的主要性能指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)制定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)儀器精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、可報(bào)告范圍、儀器間比對(duì)等指標(biāo)。結(jié)果 LightCycler Nano精密度批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為2.63%、1.51%，批間CV為6.2%、4.15%；準(zhǔn)確度與室間質(zhì)控物比較，5個(gè)標(biāo)本均在靶值區(qū)間內(nèi)；靈敏度檢測(cè)CV≤10%；可報(bào)告范圍為最大稀釋比例1∶100；與比對(duì)儀器的比對(duì)結(jié)果偏差結(jié)果均小于15%。結(jié)論 羅氏LightCycler Nano熒光定量PCR儀5項(xiàng)性能經(jīng)驗(yàn)證后與廠家提供的性能參數(shù)相符，可以用于臨床檢測(cè)。

LightCycler Nano； PCR； 性能評(píng)價(jià)； 精密度

目前聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量檢測(cè)技術(shù)在各級(jí)實(shí)驗(yàn)室中使用越來(lái)越廣泛[1]，其中ABI公司7700、7500型96孔PCR儀應(yīng)用較為廣泛，但很多實(shí)驗(yàn)室對(duì)通量要求不高[2],同時(shí)大部分省市級(jí)檢驗(yàn)科PCR結(jié)果報(bào)告時(shí)間為3 d左右，原因之一為積攢足夠批量標(biāo)本后進(jìn)行檢測(cè)，大大降低了報(bào)告及時(shí)率，一定程度上影響患者就診效率，增加醫(yī)療開支，羅氏新推出的LightCycler Nano 32孔熒光定量PCR儀，具有中等通量，高精確度，支持快速PCR，軟件分析直觀，價(jià)格為常規(guī)PCR的一半，體積小等特點(diǎn)，能夠在大大縮短運(yùn)轉(zhuǎn)周期的同時(shí)減低實(shí)驗(yàn)室成本消耗，同時(shí)能為科研個(gè)體化、低通量、快速提供一個(gè)個(gè)人化的定量平臺(tái)[3]。同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科在使用LightCycler Nano后，對(duì)其主要性能指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 主要儀器：LightCycler Nano熒光定量PCR儀(美國(guó)羅氏公司)，低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，生物安全柜等。試劑：乙型肝炎病毒(HBV)-PCR熒光定量檢測(cè)試劑盒(日本Takara公司)。標(biāo)準(zhǔn)血清，上海臨床檢驗(yàn)中心提供。檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源：收集足夠量的患者血清20份。

1.2 方法

1.2.1 精密度檢測(cè) 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)制定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)EP15A要求收集兩個(gè)水平(Level 2低值、Level 1高值)的患者血清，批內(nèi)精密度一天各測(cè)定20次，計(jì)算平均值和變異系數(shù)(CV)值；批間精密度，每日各測(cè)一次，連續(xù)20 d，計(jì)平均值和CV值。

1.2.2 準(zhǔn)確度檢測(cè) 使用參加上海市臨檢中心下發(fā)的5份室間質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，按照CLSI-EP15A規(guī)則，檢測(cè)本室檢測(cè)值是否落在靶值范圍內(nèi)或靶值在TEa(CLIA′88)允許范圍內(nèi)。

1.2.4 可報(bào)告范圍 收集高值即檢測(cè)上限(HBV-DNA 1.00×107IU/mL)患者標(biāo)本。將患者標(biāo)本用廠家指定的稀釋液按比例進(jìn)行稀釋后上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)其最高稀釋倍數(shù)是否高于廠家指定值(1∶100)。計(jì)算測(cè)試均值與理論值的比值，如在80%～120%之內(nèi)的最大稀釋度，為本室可接受的最大稀釋度。

1.2.5 儀器間比對(duì) 準(zhǔn)備5份標(biāo)本，濃度覆蓋醫(yī)學(xué)決定水平。在基準(zhǔn)儀器和比對(duì)儀器(ABI 7700)上檢測(cè)這5份標(biāo)本，每份標(biāo)本檢測(cè)2 次取均值計(jì)算比對(duì)儀器和基準(zhǔn)儀器之間的結(jié)果偏差(CV)百分比。5份標(biāo)本CV≤15%為符合要求。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，兩變量間線性關(guān)系分析采用直線相關(guān)及回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 儀器精密度檢測(cè)結(jié)果 批內(nèi)精密度：低值均值±s為4.45±0.12，CV為2.63%，高值均值±s為6.52±0.1，CV為1.51%。批間精密度：低值均值±s為4.41±0.32，CV為6.2%，高值均值±s為6.39±0.2，CV為4.15%。本室檢測(cè)值均落在廠家提供的CV范圍內(nèi)或在TEa(CLIA′88)允許范圍內(nèi)。

2.2 準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果 本室檢測(cè)值0、4.76、5.71、3.56、6.74均落在靶值范圍內(nèi)或靶值在TEa(CLIA′88)允許范圍內(nèi)(0～0、4.39～5.39、5.34～6.34、3.42～4.42、6.38～7.38)。

2.3 靈敏度驗(yàn)證結(jié)果 本室檢測(cè)結(jié)果為3.543，s為0.165，CV為4.67%，符合廠家要求范圍內(nèi)(CV≤10%)。

2.4 可報(bào)告范圍驗(yàn)證結(jié)果 按照廠家最大稀釋倍數(shù)1∶100后，測(cè)試均值為5.98，理論值為5.81，測(cè)試均值與理論值的比值為102.84%，在80%～120%之內(nèi)。1∶100為本科室可接受的最大稀釋度，符合廠家提供的最高稀釋倍數(shù)。

2.5 儀器間比對(duì)結(jié)果 5份標(biāo)本比對(duì)儀器和基準(zhǔn)儀器之間的結(jié)果偏差(CV)百分比分別為0.0%、0.1%、2.1%、0.3%、2.5%均小于15%符合要求。

3 討 論

經(jīng)驗(yàn)證羅氏LightCycler Nano 32孔熒光定量PCR儀，精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、可報(bào)告范圍、儀器間比對(duì)5個(gè)項(xiàng)目的各項(xiàng)性能指標(biāo)與廠家提供的性能參數(shù)相符。定量PCR儀主要借助標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)品之間對(duì)比來(lái)實(shí)現(xiàn)定量[4-5]，對(duì)于定量PCR系統(tǒng)，重要性能除了傳統(tǒng)PCR的升溫速度及溫控穩(wěn)定性、精確性外，更重要的在于標(biāo)本孔之間均一性，大大減少孔間差異造成的指數(shù)級(jí)放大[6]。羅氏LightCycler Nano 32孔熒光定量PCR儀，采用Therma-BaseTM熱循環(huán)專利技術(shù)和先進(jìn)的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，徹底消除邊緣效應(yīng)，可靠的光學(xué)裝置提供了完整的光譜信息，保持穩(wěn)定優(yōu)異的檢測(cè)結(jié)果[7]。熒光檢測(cè)系統(tǒng)，多色多通道檢測(cè)是當(dāng)今的主流[8]。支持所有常用的檢測(cè)染料，不需要DOX。該儀器外形小巧，其體積為常規(guī)PCR儀體積的1/4，可隨意搬動(dòng)，不受實(shí)驗(yàn)室的空間限制。便于經(jīng)常要開展實(shí)時(shí)定量PCR分析，但通量中等的實(shí)驗(yàn)室。

目前在臨床上PCR主要用于檢測(cè)各種細(xì)菌及病毒DNA，為實(shí)驗(yàn)診斷提供分子生物學(xué)依據(jù)。其中乙型肝炎病毒(HBV)-DNA檢測(cè)在各級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中最為常用。我國(guó)屬HBV感染高流行區(qū),一般人群的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性率為9.09%[9]，目前臨床上常用熒光定量PCR法檢測(cè)HBV-DNA，熒光定量PCR技術(shù)把PCR、雜交及光譜技術(shù)相融合,達(dá)到了對(duì)原始模板量定量的目的。HBV-DNA是HBV的遺傳質(zhì),HBV-DNA(PCR)是從血清中檢測(cè)HBV存在的靈敏而直接的方法[10]。LightCycler Nano 32孔熒光定量PCR儀可作為一種快速、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測(cè)儀器，其結(jié)果可以直接反映體內(nèi)HBV感染狀態(tài)及病毒載量情況，有利于判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性,更有利于臨床治療的藥物選擇和療效觀察。

此外，LightCycler Nano軟件設(shè)計(jì)更為直觀，分析設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析一體化，大大提高了檢測(cè)效率，同時(shí)小通量、支持快速PCR的設(shè)計(jì)，便于每日操作，降低檢測(cè)成本，縮短報(bào)告周期。符合當(dāng)今臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，橫向聯(lián)合科研型實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證該儀器的主要性能指標(biāo)，符合廠家提供的性能參數(shù)相符，可以在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

[1]張弛宇，徐順高，黃新祥.一種新穎簡(jiǎn)便的熒光實(shí)時(shí)RT-PCR相對(duì)定量方法的建立[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2005,32(9):883-888.

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Performance evaluation of Roche LightCycler Nano fluorogenic quantitative PCR instrument*

ZHANGYu1,LIDong1,DAIYan1,ZHENGWei-chao2,WANHai-ying1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedTongjiHospital,TongjiUniversity,Shanghai200065,China；2.MedicalCollege,AnhuiUniversityofScienceandTechnology,Huainan,Anhui232001,China)

Objective To evaluate the major performance indexes of American Roche LightCycler Nano 32 holes fluorogenic quantitative PCR instrument.Methods According to the evaluation standard formulated by the Clinical and Laboratory Standars Institute(CLSI),the precision,accuracy,sensitivity,reportable range and comparison between the instruments were evaluated.Results The coefficients of variation(CV) for within-run assays were 2.63% and 1.51% respectively;CVfor between-run assays were 6.2% and 4.15% respectively;comparing the accuracy with the between-run quality control material,the five samples were within the target value range;CVfor sensitivity was ≤ 10%;the reportable range of the maximum dilution was 1∶100;the bias of the comparison results with the comparative instrument was less than 15%.Conclusion The verified 5 items of performance in the Roche LightCycler Nano fluorogenic quantitative PCR instrument conform to the performance parameters provided by the manufacturer,indicating that this instrument can be applied in clinical testing in our laboratory.

LightCycler Nano; PCR; performance evaluation; precision

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273777)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272603)；上海市浦江人才計(jì)劃項(xiàng)目(13PJ1407300)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11040606M203)。

張宇，女，檢驗(yàn)技師，碩士研究生，研究方向是分子免疫、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)、中醫(yī)藥免疫。△

，E-mail：whysz@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.001

A

1672-9455(2015)02-0145-02

2014-05-26

2014-10-23)