不同種類酸化劑對肉雞腸道發(fā)育、消化酶活性以及微生物數(shù)量的影響

趙 旭 沈一茹 陳 杰 施壽榮*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，揚州 225125;2.上海美農(nóng)生物科技股份有限公司，上海 201807)

近年來，在畜牧生產(chǎn)中使用抗生素的弊端日趨凸現(xiàn)，飼料添加劑的安全、高效、環(huán)保等問題越來越受到人們關(guān)注。如何獲得一種無毒副作用、無殘留，既能促進動物生長，又能改善動物性食品品質(zhì)的添加劑，已經(jīng)成為科研及畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域的一個重要議題。酸化劑作為一種高效、無污染、無殘留的天然保健型飼料添加劑，具有降低動物消化道pH、促進有益菌、抑制有害菌、提高消化酶活性、增加營養(yǎng)物質(zhì)消化率和增強動物機體免疫力等多種生物學功能［1－3］，可以考慮將其作為抗生素的替代品廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中。眾所周知，動物消化道是飼糧營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，飼糧營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收率的高低與消化道環(huán)境條件息息相關(guān)［4］。以往的研究中曾經(jīng)有用酸化劑飼喂肉雞的報道，但關(guān)于比較不同種類酸化劑對肉雞腸道發(fā)育和微生物影響的研究卻尚少。本研究旨在通過探討飼料中添加相同氫離子(H+)濃度的不同種類酸化劑對肉雞腸道相對長度和相對重量、小腸消化酶活性以及盲腸微生物數(shù)量的影響，為酸化劑在肉雞生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用酸化劑［吸附磷酸(phosphoric acid，PA)、微囊化磷酸(coated phosphoric acid，CPA)、吸附磷酸乳酸(phosphoric acid+lactic acid，PLA)、富馬酸(fumaric acid，F(xiàn)UA)、甲酸(form ic acid，F(xiàn)A)和檸檬酸(citric acid，CA)］均由上海美農(nóng)生物科技股份有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選用1日齡愛拔益加(AA)肉公雞840只，隨機分為7個處理，每個處理6個重復，每個重復20只雞。對照組飼喂不添加酸化劑的基礎(chǔ)飼糧，為參照NRC(1994)雞的營養(yǎng)需要配制的配合飼料，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加吸附磷酸(0.36%)、微囊化磷酸(0.59%)、吸附磷酸乳酸(0.18%吸附磷酸+1.33%吸附乳酸)、富馬酸(0.42%)、甲酸(1.03%)和檸檬酸(0.79%)的試驗飼糧，各試驗組H+濃度均為9.18 mmol/kg(計算值，前期研究發(fā)現(xiàn)當H+濃度為此值時效果最佳)。試驗期42 d。肉仔雞采用平養(yǎng)，自由采食，充足飲水，按正常免疫程序進行免疫接種。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.3 樣品的采集

分別于試驗的第21和42天，每個重復選取2只體重接近的健康肉雞空腹8 h后飼喂6 h，頸靜脈放血處死，取十二指腸、空腸、回腸、左側(cè)盲腸和直腸去食糜用于測定腸道相對長度和相對重量;取十二指腸、空腸和回腸食糜，－20℃保存，用于測定小腸消化酶活性;結(jié)扎右側(cè)盲腸兩端，立即用于測定盲腸微生物數(shù)量。

1.4 檢測指標

1.4.1 腸道相對長度

分別用各腸段長度與肉雞活體重的比值表示。

1.4.2 腸道相對重量

分別用各腸段重量(將腸道剪開，由同一人同一力度利用玻璃片將腸道食糜刮除)與肉雞活體重的比值表示。

1.4.3 小腸消化酶活性

樣品的前處理:取冷凍小腸(十二指腸、空腸和回腸)食糜稱重，按重量/體積(m/v)=1/5加入相應(yīng)體積的4℃蒸餾水，冰浴下勻漿30 s，4℃，3 500 r/m in離心10 m in，取上清液用于胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的測定。

胰蛋白酶活性的測定:采用施韋爾特－竹中法。胰蛋白酶水解專一性底物苯甲酰－精氨酸－硝基苯氨鹽酸鹽，生成黃色的對硝基苯胺，在410 nm處測定吸光度(OD)值。酶活性單位定義為:在pH 8.2、40 ℃的條件下，1 m in產(chǎn)生 1 μmol對硝基苯胺定義為1個酶活性單位。

糜蛋白酶活性的測定:采用胡梅爾法。糜蛋白酶可水解苯甲酰－L－酪氨酸乙酯，用紫外分光光度計于波長256 nm處測定苯甲酰－L－酪氨酸乙酯的減少量可反映樣品中糜蛋白酶活性的高低。酶活性單位定義為:在pH 7.8、25℃的條件下，1 m in產(chǎn)生1μmol苯甲酰－L－酪氨酸定義為1個酶活性單位。

1.4.4 盲腸微生物

樣品稀釋:在無菌操作臺上取腸道內(nèi)容物0.5 g左右，分別置于滅菌管內(nèi)，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋液稀釋成為 10－1，混勻，吸取 0.3m L 稀釋液轉(zhuǎn)入盛有2.7 m L稀釋液試管中稀釋至10－2，按此方法再依次將盲腸內(nèi)容物稀釋至 10－3、10－4、10－5。

滴種:用移液槍吸取100μL稀釋液滴入培養(yǎng)基，每個稀釋度做2個重復，以便取其平均值。大腸桿菌在37℃培養(yǎng)箱有氧培養(yǎng)24 h;乳酸桿菌在37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h。

菌群培養(yǎng)及計數(shù):生長良好的大腸桿菌在麥康凱瓊脂上為紅色或粉紅色菌落，表面光滑且有光澤，凸起，菌落周圍有混濁膽鹽沉淀圈，邊緣整齊不透明。生長良好的乳酸桿菌在LBS培養(yǎng)基上為乳白色稍偏黃的圓形小菌落，表面光滑，中央呈乳狀突起，邊緣整齊不透明，質(zhì)地軟。將培養(yǎng)好的平皿選擇合適的濃度梯度以30～300為宜，根據(jù)菌落可數(shù)性原則，對微生物進行平板菌落計數(shù)，求其平均值并計算每克腸道內(nèi)容物所含的細菌數(shù)，以對數(shù)值(lgCFU/g)表示。

對微生物進行平板菌群計數(shù)，為了防止誤差，固定一人從頭至尾進行菌落計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，差異顯著時采用LSD法進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同種類酸化劑對肉雞腸道相對長度的影響

由表2可知，吸附磷酸組、微囊化磷酸組、吸附磷酸乳酸組、富馬酸組、甲酸組和檸檬酸組肉雞在21和42日齡時各腸段的相對長度與對照組相比均差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 不同種類酸化劑對肉雞腸道相對重量的影響

由表3可知，吸附磷酸組、微囊化磷酸組、吸附磷酸乳酸組、富馬酸組、甲酸組和檸檬酸組肉雞在21和42日齡時各腸段的相對重量與對照組相比均差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 不同種類酸化劑對肉雞小腸食糜消化酶活性的影響

由表4可知，肉雞21日齡時，甲酸組和檸檬酸組的胰蛋白酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05);微囊化磷酸組和檸檬酸組的糜蛋白酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05)。肉雞42日齡時，除微囊化磷酸組外，其他各試驗組的胰蛋白酶活性均較對照組有顯著提高(P＜0.05);除吸附磷酸乳酸組和甲酸組外，其他各試驗組的糜蛋白酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05)，且以吸附磷酸組效果最為明顯。

2.4 不同種類酸化劑對肉雞盲腸微生物數(shù)量的影響

由表5可知，各種酸化劑的添加均對肉雞盲腸乳酸桿菌數(shù)量無顯著影響(P＞0.05)，但飼糧中添加富馬酸、甲酸和檸檬酸均顯著降低了42日齡肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量(P＜0.05)。

表2 不同種類酸化劑對肉雞腸道相對長度的影響Table 2 Effects of different kinds of acidifier on relative intestinal tract length of broiler chickens cm/kg BW

表3 不同種類酸化劑對肉雞腸道相對重量的影響Table 3 Effects of different kinds of acidifier on relative intestinal tractweight of broiler chickens g/kg BW

3 討論

3.1 不同種類酸化劑對肉雞腸道發(fā)育和消化酶活性的影響

肉雞營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收主要在腸道中進行，因此肉雞的腸道發(fā)育和消化酶活性將直接影響到其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和代謝。目前，關(guān)于酸化劑在畜禽生產(chǎn)中促進腸道發(fā)育和消化酶活性的應(yīng)用研究報道主要集中在仔豬上，而在肉雞方面的研究相對較少。郭鵬等［2］和羅四維［5］均研究表明，復合酸化劑的添加可顯著降低肉雞腸道pH，提高其總蛋白酶活性?？茁奋姷龋?］研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中配合添加酸化劑能使肉仔雞腸內(nèi)容物總蛋白酶活性增強。本試驗研究了不同種類酸化劑對肉雞各腸段相對長度和相對重量以及小腸胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影響，結(jié)果顯示，單一無機酸化劑(吸附磷酸)、緩釋酸化劑(微囊化磷酸)、復合酸化劑(吸附磷酸乳酸)以及單一有機酸化劑(富馬酸、甲酸和檸檬酸)均對肉雞的腸道發(fā)育無顯著影響，但這些酸化劑的添加均可不同程度地提高肉雞小腸蛋白酶活性。酸化劑的這種促進小腸蛋白酶活性的現(xiàn)象很可能與酸化劑降低了肉雞胃內(nèi)pH，從而激活了胃蛋白酶，使得蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物增多，進而刺激小腸分泌較多的蛋白酶使蛋白質(zhì)完全分解吸收密切相關(guān)［3，7］。

表4 不同種類酸化劑對肉雞小腸食糜消化酶活性的影響Table 4 Effects of different kinds of acidifier on small intestinal digestive enzyme activities of broiler chickens

表5 不同種類酸化劑對肉雞盲腸微生物數(shù)量的影響Table 5 Effects of different kinds of acidifier on cecalm icrobiota number of broiler chickens lgCFU/g

3.2 不同種類酸化劑對肉雞盲腸微生物的影響

肉雞盲腸中存在著大量的微生物，且大多數(shù)有害菌群生長的適宜pH都是中性偏堿，如大腸桿菌pH為6.0～8.0，而乳酸桿菌等有益菌群則適宜于在酸性環(huán)境中生長繁殖(pH 為 5.4～6.4)［8］。近年來，隨著抗生素時代的過去，利用酸化劑調(diào)節(jié)盲腸微生物得到了越來越多的關(guān)注。羅四維［5］研究表明，復合酸化劑的添加可以降低21和42日齡肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量，但對乳酸桿菌數(shù)量沒有顯著影響。朱宇旌等［9］研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加包被酸化劑能夠提高肉雞盲腸乳酸桿菌數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量。李軍［10］研究指出，飼糧中添加磷酸－乳酸復合酸化劑可以降低21和42日齡肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量，但對乳酸桿菌數(shù)量沒有顯著影響。在本試驗中的結(jié)果顯示，飼糧中添加單一有機酸化劑(富馬酸、甲酸和檸檬酸)顯著降低了42日齡肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量，但單一無機酸化劑(吸附磷酸)、緩釋酸化劑(微囊化磷酸)和復合酸化劑(吸附磷酸乳酸)的添加均對肉雞盲腸乳酸桿菌和大腸桿菌的數(shù)量無顯著影響。由此可以看出，有機酸化劑更有助于腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，減少病原菌感染，為肉雞提供一個健康的腸道環(huán)境。而有機酸化劑較無機酸化劑具有更好的抑制病原菌的作用可以解釋為有機酸在較低pH下，通常處于非解離狀態(tài)，非解離的有機酸可以透過細菌和霉菌的細胞膜，一旦進入細胞內(nèi)，由于胞質(zhì)中較高的pH，使有機酸解離，降低胞內(nèi)pH，從而影響細菌酶的活性，發(fā)揮抑菌作用［11－12］。

4 結(jié) 論

①飼糧中添加單一無機酸化劑(吸附磷酸)可以提高42日齡肉雞小腸胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。

②飼糧中添加緩釋酸化劑(微囊化磷酸)可以增強21和42日齡肉雞小腸糜蛋白酶活性。

③飼糧中添加復合酸化劑(吸附磷酸乳酸)可以增強42日齡肉雞小腸胰蛋白酶活性。

④飼糧中添加單一有機酸化劑(富馬酸、甲酸和檸檬酸)可以增強21和42日齡肉雞小腸胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，降低42日齡肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量。

［1］ 陳代文，張克英，王萬祥，等.酸化劑、益生素和寡糖對斷奶仔豬糞中微生物菌群和免疫功能的影響及其互作效應(yīng)研究［J］.動物營養(yǎng)學報，2006，18(3):172－178.

［2］ 郭鵬，盧建，李軍，等.復合酸化劑對肉仔雞消化道pH值和消化酶活性的影響［J］.飼料工業(yè)，2011，32(11):32－35.

［3］ 張相倫，楊在賓.酸化劑改善動物胃腸道內(nèi)環(huán)境機理的研究［J］.飼料博覽，2013(11):22－24.

［4］ 張宏福，張莉，方路，等.異麥芽低聚糖對斷奶仔豬腸道VFA濃度、pH值及黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響［J］.動物營養(yǎng)學報，2002，14(1):19－24.

［5］ 羅四維.復合酸化劑對肉仔雞生產(chǎn)性能和消化道內(nèi)環(huán)境的影響［D］.碩士學位論文.揚州:揚州大學，2010:28－50.

［6］ 孔陸軍，鄭雅文，賴長華，等.EM和酸化劑配合添加對肉仔雞消化酶活性和血液生化指標及鈣磷代謝的影響［J］.山東家禽，2003(6):10－13.

［7］ 朱劍鋒，周海泳，胡學鋒，等.飼料酸化劑的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢［J］.廣東飼料，2013，22(3):32－34.

［8］ 秦圣濤，張宏福，唐湘方，等.酸化劑主要生理功能和復合酸選配依據(jù)［J］.動物營養(yǎng)學報，2007，19(增刊):515－520.

［9］ 朱宇旌，吳蕓彤，季文彥，等.不同環(huán)境下包被酸化劑對肉仔雞生長性能、消化道內(nèi)環(huán)境及血清生化指標的影響［J］.動物營養(yǎng)學報，2012，24(5):886－896.

［10］ 李軍.磷酸－乳酸復合酸化劑對肉仔雞生產(chǎn)性能的影響［D］.碩士學位論文.揚州:揚州大學，2011:30－38.

［11］ 張祥，張子宏.飼料酸化劑替代抗生素的作用機制［J］.飼料研究，2006(9):22－24.

［12］ 馮尚連，尚建鋼，孫玥瀅，等.乳酸對仔豬腸道大腸桿菌和乳酸桿菌的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2011，23(3):506－510.