三疣梭子蟹幼蟹的蛋氨酸需要量

金 敏 王猛強 霍雅文 黃文文 候迎梅 丁立云 周歧存

(寧波大學海洋學院，魚類營養(yǎng)研究室，寧波 315211)

蛋氨酸是一種含硫氨基酸，也是一種十分重要的氨基酸并參與蛋白質的合成［1］。在大多數(shù)植物蛋白質源中，蛋氨酸被認為是第一限制性氨基酸，然而，近年來由于魚粉資源匱乏，造成價格攀升，因此越來越多的植物蛋白質源用以替代魚粉而被應用于飼料配方中［2］。有研究表明，飼料中蛋氨酸含量不足會導致氨基酸組成不平衡，進而造成飼料利用水平下降，蛋白質合成降低，甚至影響動物的生長性能［1，3］。L－蛋氨酸參與了生物體內許多代謝反應，如S－腺苷甲硫氨酸(SAM)的合成［4］，以及 L－半胱氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、硫酸鹽類、卵磷脂以及其他磷脂的合成［5］。L－蛋氨酸還是一種生糖氨基酸，參與D－葡萄糖和糖元的形成［1］。然而，當飼料中加入過量的蛋氨酸時，會導致機體中毒，從而影響生長［6］，蛋氨酸中毒現(xiàn)象可能是因肝臟中積累過多的SAM造成的［7］。因此，需要研究動物對飼料中蛋氨酸的適宜需求量，對于研制科學合理的人工配合飼料配方具有重要意義。

目前關于水生動物對蛋氨酸需要量的研究主要集中于魚類，例如大西洋鮭(Salmo salar)［8］、尖吻鱸(Lates calcarifer)［9］、斑點叉尾 (Ictalurus punctatus)［10］、軍 曹魚 (Rachyentron canadum)［11］及歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)［12］等都已有相關報道;對甲殼類的蛋氨酸需求的研究中，已有報道得出大西洋溝蝦(Palaemonetes varians)對飼料中蛋氨酸需要量為0.9%～1.1%(占飼料蛋白質的2.0% ～2.4%)［13］、日本對蝦(Marsupenaeus japonicus)為 0.7%(占飼料蛋白質的 1.4%)［14］、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)為0.9%(占飼料蛋白質的2.4%［15］或 2.9%［16］)、凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)為 0.89%(占飼料蛋白質的 2.16%)［17］，葉金云等［18］對中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)研究認為其對飼料中蛋氨酸的需要量為1.12%(占飼料蛋白質的2.95%)。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)主要養(yǎng)殖區(qū)域分布在中國的沿海地區(qū)，以及韓國和日本等國［19－24］，其生長速度快，味道鮮美，市場價值高，歷來深受消費者的歡迎。到2012年，國內三疣梭子蟹養(yǎng)殖產量已達到99 580 t［25］，然而，目前三疣梭子蟹的養(yǎng)殖大多依賴于投喂冰鮮魚，關于其飼料營養(yǎng)需求研究［23－24，26］較少，也尚未有蛋氨酸需要量的報道。因此，本試驗設計在相同的基礎飼料中添加不同水平的蛋氨酸，對三疣梭子蟹幼蟹開展養(yǎng)殖試驗，研究飼料蛋氨酸含量對其生長性能、常規(guī)營養(yǎng)成分、肌肉氨基酸組成的影響，確定三疣梭子蟹幼蟹對蛋氨酸的適宜需要量。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配制

本試驗以魚粉、小麥蛋白粉、豆粕和磷蝦粉為蛋白質源，魚油和豆油(1∶1)為脂肪源配制6組等氮等能(粗蛋白質 49.5%，總能 18.2 MJ/kg)的試驗飼料，飼料中晶體L－蛋氨酸的添加水平分別為0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和 1.25%，實測各飼料蛋氨酸含量分別為 0.61%、0.77%、0.97%、1.18%、1.44%和 1.64%。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，試驗飼料的氨基酸組成見表2。在配制試驗飼料之前，各種原料經粉碎機粉碎后過80目篩，然后按照表1的配方準確稱量各種飼料原料，各種維生素和礦物質的混合物等微量添加成分采取逐級擴大法混合均勻，再添加油和大豆卵磷脂混合均勻，將混合好的原料全部倒入混合機中，邊混合邊加水，約加至35%左右的水分，用雙螺桿擠壓機(F－26華南理工大學機械工程研究所制造)壓制成粒徑為3和5 mm的飼料，再用制粒機(G－250華南理工大學機械工程研究所制造)切割制粒，置90℃烘箱中熟化30 m in，取出自然風干至含水分在10%左右，最后放入做好標記的封口袋中于－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

續(xù)表1

表2 試驗飼料的氨基酸組成(干物質基礎)Table 2 Am ino acid composition of experimental diets(DM basis) %

續(xù)表2

1.2 試驗管理

飼養(yǎng)試驗在浙江寧波象山鑫億鮮活水產有限公司的養(yǎng)殖基地進行，試驗所用的三疣梭子蟹幼蟹購自象山兢業(yè)育苗廠，選用當年人工孵化的同一批蟹苗。正式試驗前，試驗蟹一直暫養(yǎng)于1畝(1畝=677 m2)左右的水泥池中，并以商業(yè)飼料飽食投喂，暫養(yǎng) 2周。選擇(11.27±0.13)g的幼蟹為試驗對象，進行分組試驗。本試驗采用單體框養(yǎng)的養(yǎng)殖模式，選取360只大小規(guī)格一致的健康幼蟹隨機放在180個塑料筐(80 cm×40 cm×40 cm)中。塑料筐中間用1塊塑料擋板隔開，平均分為2個部分，因此每個塑料筐可放養(yǎng)2只試驗蟹，每個部分放置2個相同的塑料盒(25 cm×15 cm×10 cm)，一個裝2/3的沙子用作三疣梭子蟹的棲息場所，另一個用作投料臺。試驗以60只試驗蟹為1組，養(yǎng)殖于30個塑料筐中，每組設3個重復，每個重復10個塑料筐(共20只試驗蟹)，每個重復的10個筐緊挨在一起排成一列。所有的塑料筐放置在同一水泥池(70 m×80 m×0.6 m)中，為了減少外界環(huán)境因素的干擾，每個重復隨機放置于水泥池的不同位置。每天投喂1次，日投喂量為其體重的6%～8%，投喂時間為17:00，第2天早晨檢查攝食情況并撈取殘餌，以調整其投餌量，盡量讓飼料在60 m in內被試驗蟹攝食完，后期的投喂量為體重的3%～5%。因養(yǎng)殖采取單體框養(yǎng)，養(yǎng)殖工作量較大且投喂量會根據(jù)攝食情況進行調整，每天殘餌量很少或幾乎沒有，因此沒有對殘餌進行收集處理。養(yǎng)殖過程中每天換水。試驗用水采用沙濾的天然海水，試驗期間不間斷充氣，試驗水溫為 26～28℃，溶解氧濃度為 6.5～7.0 mg/m L，pH 為 7.5 ～ 7.8，鹽度為 26‰ ～ 28‰，養(yǎng)殖試驗持續(xù)8周。

1.3 樣品采集和分析方法

試驗結束時饑餓24 h，逐個稱重并記錄個數(shù)。每組隨機取2～3只蟹，保存于－20℃冰箱，用于全蟹常規(guī)營養(yǎng)成分分析，分析方法參照AOAC(1995)［27］。水分含量采用105℃常壓干燥法測定;粗蛋白質含量采用凱氏定氮法(總氮×6.25)測定;粗脂肪含量采用索氏抽提法測定，提取有機試劑為石油醚;粗灰分含量采用550℃高溫爐灼燒法測定。

每組取5～6只蟹，用剪子剪出肌肉，保存于－20℃冰箱，其中小部分用以分析肌肉的氨基酸組成，分析采用日立L－8900氨基酸自動分析儀，參照文獻［28］的方法進行。其余剩余肌肉用于常規(guī)營養(yǎng)成分分析，分析方法同全蟹常規(guī)營養(yǎng)成分分析方法。

蛋氨酸溶失率測定參照 Cruz-Suárez等［29］的方法。隨機選擇1組飼料，稱取5 g置于盛有500 m L養(yǎng)殖試驗海水的燒杯中，分別浸泡30、60和120 m in取出烘干稱重，粉碎測其蛋氨酸含量。

1.4 計算公式

增重率(WGR，%)=100×

(終末均重－初始均重)/初始均重;

特定生長率(SGR，%/d)=100×

(ln終末均重－ln初始均重)/試驗天數(shù);

成活率(%)=100×終末存活蟹個數(shù)/

初始存活蟹個數(shù);

飼料效率(FE)=(終末蟹總重+死亡蟹

總重－初始蟹總重)/攝食量;

蛋白質效率(PER，%)=100×蟹體凈增重/

(飼料攝入量×飼料粗蛋白質含量)

蛋白質沉積率(PPV，%)=100×(終末體重×

終末蟹粗蛋白質含量－初始體重×初始蟹

粗蛋白質含量)/(飼料攝入量×飼料

粗蛋白質含量)。

1.5 統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時采用Duncan氏法對各組間數(shù)據(jù)進行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 飼料中蛋氨酸含量對三疣梭子蟹幼蟹生長指標的影響

由表3可知，飼料中蛋氨酸含量對成活率沒有顯著影響(P＞0.05)，但是對體增長指標WGR、SGR以及飼料利用指標FE、PPV和PER影響顯著(P＜0.05)。當飼料中蛋氨酸含量由0.61%增加到0.97%，WGR 和 SGR 顯著提高(P＜0.05);當飼料中蛋氨酸含量由 0.97%增加到 1.44%，WGR和SGR無顯著差異(P＞0.05);當飼料中蛋氨酸含量由1.44%增加到1.64%，WGR和SGR反而顯著下降(P＜0.05)。PPV、FE 和 PER 與 WGR、SGR 呈基本相同的變化趨勢。以SGR為評價指標，通過折線模型得出三疣梭子蟹幼蟹對飼料中蛋氨酸的需要量為 1.07%(圖 1)，占飼料蛋白質的 2.16%(當飼料半胱氨酸含量在 0.42%～0.47%時)。因晶體氨基酸在水中會有溶失，因此本試驗選擇了其中一組飼料進行了蛋氨酸溶失率的測定，飼料中蛋氨酸溶失率結果見表 4，浸泡 30、60和120 m in后蛋氨酸的溶失率分別為 4.77%、10.21%和17.52%。而根據(jù)養(yǎng)殖的實際情況，三疣梭子蟹是在60 m in內攝食完，因此，考慮溶失率，本試驗條件下，三疣梭子蟹幼蟹對飼料中蛋氨酸的需要量為0.96%，占飼料蛋白質的1.94%。

表3 飼喂不同蛋氨酸含量飼料的三疣梭子蟹幼蟹的生長指標Table 3 Grow th indices of juvenile sw imm ing crab fed diets containing different contents of Met(n=3)

2.2 飼料中蛋氨酸含量對三疣梭子蟹幼蟹全蟹及肌肉成分的影響

由表5可知，飼料中蛋氨酸含量對三疣梭子蟹全蟹及肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分均無顯著影響(P＞0.05)。

2.3 飼料中蛋氨酸含量對三疣梭子蟹幼蟹肌肉氨基酸組成的影響

由表6可知，肌肉氨基酸組成不受飼料中蛋氨酸含量的顯著影響(P＞0.05);各組肌肉必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(ΣEAA/ΣNEAA)為0.77～0.80。

3 討論

本試驗結果表明，飼料中蛋氨酸含量影響三疣梭子蟹的生長性能，在本研究中，當飼料中蛋氨酸含量為0.61%～1.94%時，各組的 WGR和 SGR表現(xiàn)為先增加后降低的變化趨勢，這與軍曹魚［11］、印 度 鯪 (Cirrhinus mrigala)［30］和 大 黃 魚(Pseudosciaenacrocea)［31］的研究結果相一致。飼料中蛋氨酸含量過低會導致生長緩慢以及飼料利用率過低，而攝取高含量蛋氨酸飼料也會導致動物生長緩慢［1］。本試驗以SGR為指標，通過折線回歸模型得出三疣梭子蟹幼蟹飼料中蛋氨酸的最適含量為1.07%，占飼料蛋白質的2.16%，若考慮本試驗飼料在水中的溶失，以浸泡60 m in后的溶失率換算，則其對蛋氨酸的需要量為0.96%，占飼料蛋白質的1.94%。

圖1 飼料蛋氨酸含量與三疣梭子蟹幼蟹特定生長率的關系Fig.1 Relationship between dietary Met content and SGR of juvenile sw imm ing crab

表4 在海水中浸泡不同時間飼料中蛋氨酸的溶失率(干物質基礎)Table 4 Diratey Met dissolve-loss rate immersed in seawater w ith differentm inutes(DM basis) %

表5 飼喂不同蛋氨酸含量飼料的三疣梭子蟹幼蟹的全蟹及肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分(濕重基礎)Tab 5 Common nutrient composition in whole body and muscle of juvenile sw imm ing crab fed diets containing different contents of Met(wetweight basis，n=3)

在水產動物中關于蛋氨酸需要量的報道多見于魚類中，已有的研究結果表明魚類對蛋氨酸的需要量為飼料蛋白質的 1.3% ～ 3.3%［8－12，32－44］。本試驗確定三疣梭子蟹幼蟹蛋氨酸需要量為飼料蛋白質含量 2.16%，與凡納濱對蝦(2.16%)［17］和大西洋溝蝦(2.0%～2.4%)［13］的研究結果相似，但高于日本對蝦(1.4%)［14］，低于斑節(jié)對蝦(2.4%［15］或 2.9%［16］)和中華絨螯蟹(2.95%)［18］的研究結果。從以上研究結果可以看出，不同的水產動物之間對飼料中蛋氨酸的需要量差異較大，甚至在同一品種間也會存在較大的差異，這可能是由飼養(yǎng)條件及養(yǎng)殖模式的不同、飼料原料及氨基酸組成不同所引起的［31，33］;此外，當飼料中半胱氨酸供應不足時，蛋氨酸會轉變成胱氨酸來滿足動物對半胱氨酸的需要，反之當飼料中半胱氨酸足夠時，有節(jié)約蛋氨酸的作用，因此這也會導致得到的研究結果差異較大［1］，本試驗飼料配方中半胱氨酸含量在0.42%～0.47%之間。有研究表明，外界的環(huán)境因素，如水溫、水流及養(yǎng)殖密度等也會引起魚類和甲殼類對營養(yǎng)需求評估的差異［45］。還有一些研究顯示氨基酸的需要量可能與飼料蛋白質含量密切相關，因此不同的飼料蛋白質含量對氨基酸需要量的確定也有影響［46－48］。目前關于飼料氨基酸營養(yǎng)對三疣梭子蟹影響的研究尚處于空白，也未有蛋氨酸和半胱氨酸在三疣梭子蟹體內轉化作用的報道，今后需進一步開展研究確定和完善。

表6 飼喂不同蛋氨酸含量飼料的三疣梭子蟹幼蟹的肌肉氨基酸組成Table 6 Am ino acid composition ofmuscle of juvenile sw imm ing crab fed diets containing different contents of Met(n=3)

飼料中蛋氨酸含量影響了三疣梭子蟹幼蟹對飼料的利用，F(xiàn)E、PER和PPV的最高值出現(xiàn)在蛋氨酸含量為1.44%組，但與蛋氨酸含量為0.97%和1.18%組之間并無顯著差異，這和生長結果較類似。在本試驗中，F(xiàn)E、PER和PPV均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，當飼料中蛋氨酸含量為0.61%時，F(xiàn)E、PER和PPV都表現(xiàn)為最低，若適當增加蛋氨酸含量，可以顯著提高FE、PER和PPV，這表明適量的蛋氨酸含量可以提高三疣梭子蟹幼蟹的FE、PER及PPV，而過低或過高的蛋氨酸含量反而獲得較低的FE、PER和PPV，類似的結果在石斑魚 (Palaemonetes varians)［38］、巖 魚 (Sebastes schlegeli)［39］、軍曹魚［11］和印度鯪［30］中也均有報道，這可能是因為適宜的蛋氨酸含量使氨基酸池達到平衡，生理各項吸收和代謝功能等達到最佳狀態(tài)，而使FE、PER和PPV都高于含量過低或過高組。

飼料中蛋氨酸含量對三疣梭子蟹全蟹以及肌肉的常規(guī)營養(yǎng)成分影響不顯著。在凡納濱對蝦的研究中顯示除肌肉中的粗脂肪含量外，飼料中蛋氨酸含量對凡納濱對蝦全蝦及肌肉的常規(guī)營養(yǎng)成分均無顯著影響［17］;在石斑魚的研究中表明飼料中蛋氨酸含量對肌肉中粗灰分含量無顯著影響［38］;在黑鯛(Sparusmacrocephalus)的研究中得出飼料中蛋氨酸含量對全魚的粗脂肪、粗灰分以及水分含量均無顯著影響，對肌肉中粗灰分及水分也無顯著影響［49］。但也有研究表明飼料中蛋氨酸含量對體成分有顯著影響，這在巖魚［39］、印度鯪［30］、北極紅點鮭(Salvelinus alpinus)［35］和黃

魚(Seriolaquin oueradiata)［40］中均有報道。有研究提出氨基酸含量的不平衡會導致機體蛋白質合成降低［50］，本試驗中蟹體及肌肉粗蛋白質含量各組間無顯著差異，這可能是因為本試驗的基礎飼料中即使是添加低水平的蛋氨酸也尚不足以影響其他氨基酸的合成和代謝，所以對蟹體及肌肉粗蛋白質含量無顯著影響;而攝入高含量蛋氨酸飼料的組，蟹體及肌肉蛋粗白質含量卻并沒有顯著高于其他組，可能是由于攝入的過多的蛋氨酸除了參與蛋白質合成也參與了其他的營養(yǎng)物質的合成代謝［4－5］，對此今后還需要更深入地探究。

許多研究表明，肌肉、血液或其他組織中必需氨基酸的含量可以用來衡量飼料中氨基酸組成的狀態(tài)［51－53］。在本試驗也對肌肉組織進行了氨基酸組成分析，結果得出三疣梭子蟹幼蟹肌肉中必需氨基酸和非必需氨基酸含量以及二者比值均不受飼料中蛋氨酸含量的顯著影響。對大黃魚的研究表明飼料中蛋氨酸含量會顯著影響肌肉中蛋氨酸和異亮氨酸的含量，但不影響其他氨基酸含量［31］;對石斑魚的研究表明飼料中蛋氨酸含量對肌肉中的各必需氨基酸含量均有顯著影響［38］。本研究中各組肌肉氨基酸含量之間無顯著差異可能是因為基礎飼料中各氨基酸含量較為均衡，設計的蛋氨酸含量梯度也不足以影響肌肉中氨基酸組成，此結果也與肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分分析結果相互印證。

4 結 論

在本試驗條件下，以SGR為評價指標，通用折線回歸模型得出三疣梭子蟹幼蟹對飼料中蛋氨酸的需要量為1.07%，占飼料蛋白質的2.16%。若考慮到晶體氨基酸在水中的溶失，則三疣梭子蟹幼蟹對飼料中蛋氨酸的需要量為0.96%，占飼料蛋白質的1.94%(以蛋氨酸在海水中浸泡60 m in后的溶失率10.21%換算)。

致謝:

感謝寧波大學海洋學院魚類營養(yǎng)研究室全體成員對本試驗提供的支持和幫助，感謝象山鑫億鮮活水產有限公司提供試驗場所和養(yǎng)殖系統(tǒng)，才能使本試驗順利進行。

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