可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑對內(nèi)皮祖細胞歸巢功能的影響＊

王振河，許丹焰，李衛(wèi)華，謝 強，黃崢嶸，姜德謙△

1．廈門大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建廈門361003；2．中南大學湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科，長沙410011；

3．廈門市心血管病研究所，福建廈門361003）

環(huán)氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）是具有強大生物活性的內(nèi)生脂質(zhì)環(huán)氧化合物，具有舒張血管、抗炎等作用［1－3］。EETs在細胞內(nèi)由可溶性環(huán)氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）迅速降解［4］，使其作用明顯受限。因此，使用sEH抑制劑，抑制EETs在體內(nèi)降解可有效增加EETs在細胞內(nèi)濃度及效用。內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在干細胞移植修復心肌梗死中扮演重要角色，研究表明EETs可通過多種機制激活EPCs［5－7］。EPCs從外周向心肌組織歸巢為EPCs修復心肌梗死重要途徑［8－10］，因此，增強EPCs歸巢功能可能有效增強EPCs對梗死心肌的修復。本研究觀察不同濃度sEH抑制劑對EPCs歸巢功能的影響，以便為其在促進EPCs修復心肌梗死的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 本實驗選用6周齡清潔級雄性云南昆明小鼠（中南大學湘雅二醫(yī)院實驗動物中心提供）作為EPCs的來源；CD34、CD133、CD31、Flk－1、Dil－acLDL、FITC－UEA－1購自美國Molecular probes公司；小動物呼吸機購自美國哈佛大學；胃蛋白酶、檸檬酸抗原修復緩沖液、DAB顯色劑購自美國Vector公司。

1．2 方法

1．2．1 實驗分組 依據(jù)可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑（t－AUCB）不同濃度干預組分為6組，分別為0μmol／L t－AUCB、1μmol／L t－AUCB、10μmol／L t－AUCB、50μmol／L t－AUCB、100μmol／L t－AUCB干預組。

1．2．2 EPCs的分離、培養(yǎng) 小鼠脛骨及股骨骨髓通過密度梯度離心法分離單個核細胞，按5×105／cm密度放置預先包被fibronectin的細胞培養(yǎng)皿中，加入EBM－2培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基預先加入5%FBS和生長因子，4d后去除懸浮細胞，隔天半量更換培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡下觀察不同時間點細胞形態(tài)。

1．2．3 EPCs的鑒定 雙染色（Dil－acLDL，F(xiàn)ITC－UEA－1）：細胞培養(yǎng)7d后，依序往培養(yǎng)瓶內(nèi)加入Dil－acLDL及FITCUEA－1（10mg／L），觀察上述培養(yǎng)細胞攝取 Dil－acLDL及結(jié)合FITC－UEA－1能力，同時結(jié)合 Dil－ac－LDL、FITC－UEA－1細胞為EPCs；EPCs表面抗原鑒定：培養(yǎng)7d的細胞洗滌、離心后應(yīng)用流式細胞儀檢測 CD34、CD133、CD31、Flk－1表面標志表達。

1．2．4 t－AUCB體外對EPCs歸巢功能的影響 EPCs培養(yǎng)7 d后，上述不同濃度t－AUCB（0、1、10、50、100μmol／L）預干預24h，加入Dil－acLDL至上述細胞懸液，濃度為2μg／mL，避光孵育1h，顯微鏡下觀察Dil－acLDL吸收情況；開胸呼吸機輔助下結(jié)扎冠脈左前降支，1h后經(jīng)尾靜脈注射上述干預的EPCs，24h后處死小鼠，按不同區(qū)域分為梗死區(qū)、邊緣區(qū)、正常區(qū)，邊緣區(qū)為距離梗死區(qū)5mm，將上述各區(qū)域心臟剪成小粒，消化離心，熒光顯微鏡下記數(shù)不同區(qū)域心肌消化后Dil標記陽性細胞數(shù)。

1．3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用x±s表示，并進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，組間均數(shù)顯著性檢驗用多個樣本均數(shù)比較的方差分析（LSD－t檢驗），以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2．1 小鼠EPCs的生長情況 剛接種時骨髓來源分離的單個核細胞呈圓形，散在懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)，24～48h后，部分細胞開始貼壁；4d后首次換液，去除培養(yǎng)瓶內(nèi)未貼壁懸浮細胞，倒置相差顯微鏡下觀察貼壁細胞生長狀況（圖1），細胞呈菊花狀集落，中央為圓形細胞，周圍為梭形細胞（圖1A）；7d后，細胞集落明顯擴大，集落中央圓形細胞逐漸向梭形細胞轉(zhuǎn)化（圖1B）；第8天可見細胞形成條索狀（圖1C）；第10天細胞可達80%～90%融合，以多角形、類圓形及梭形細胞為主（圖1D）。

2．2 熒光雙染色結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察小鼠骨髓來源EPCs攝 取 Dil－acLDL、結(jié) 合 FITC－UEA－1 能 力，攝 取 DilacLDL陽性細胞呈紅色熒光，結(jié)合UEA－1陽性細胞呈綠色熒光，雙陽性細胞呈黃色熒光，結(jié)果示95%以上培養(yǎng)的細胞呈雙陽性黃色熒光：雙陽性細胞為EPCs（圖2）。

2．3 表面分化抗原流式細胞儀鑒定結(jié)果 流式細胞儀檢測結(jié)果示：相較于同型分化抗原，小鼠骨髓來源EPCs各表面分化抗原 含 量 CD34 為 （53．89±0．34）%，CD133 為 （52．79±0．67）%，CD31 為 （36．67±0．93）%，F(xiàn)lk－1 為 （43．88±0．48）%，見圖3。

圖1 內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)結(jié)果（×200）

圖2 EPCs攝取Dil－acLDL及FITC－UEA－1熒光染色結(jié)果（×200）

圖3 小鼠骨髓來源EPCs表面分化抗原流式細胞儀分析結(jié)果

2．4 t－AUCB對小鼠EPCs歸巢功能的影響

2．4．1 心肌梗死模型制作 稱重小鼠，戊巴比妥那50mg／kg腹腔注射麻醉，連接各心電圖電極，正常心電圖示S－T段在基線水平位置（圖4A），小鼠氣管插管后連接呼吸機，打開胸腔，剪開心包，暴露左心耳（圖4C）結(jié)扎冠狀動脈中1／3，結(jié)扎后可見心電圖呈ST段弓背向上抬高（圖4B），結(jié)扎遠端心肌活動度減弱（圖4D），心肌蒼白后紫紺（圖4E），表明模型制作成功（圖4）。

圖4 正常、梗死心電圖形態(tài)及心梗模型制作過程中心肌演變過程

2．4．2 不同濃度t－AUCB對EPCs歸巢至梗死心肌不同部位的影響 從0～100μmol／L t－AUCB干預組，隨著濃度增加，t－AUCB可明顯呈濃度依賴性增強EPCs歸巢至梗死心肌邊緣區(qū)、正常區(qū)及梗死區(qū)能力，與0μmol／L t－AUCB相比，1、10、50、100μmol／L t－AUCB可顯著增強EPCs歸巢至上述區(qū)域能力（P＜0．05），見表1。

表1 不同濃度t－AUCB干預對EPCs歸巢至心肌不同部位的影響（x±s）

3 討 論

EPCs從外周向心肌組織歸巢為EPCs修復心肌梗死重要途徑。觀察t－AUCB干預對EPCs歸巢的影響可發(fā)現(xiàn)：在梗死心肌邊緣區(qū)，增加t－AUCB濃度，邊緣區(qū)的EPCs明顯增多，達數(shù)百個，并且呈濃度依賴性，提示t－AUCB促進EPCs歸巢至梗死心肌邊緣區(qū)；從0μmol／L至100μmol／L，t－AUCB可呈濃度依賴性增強EPCs向心梗邊緣區(qū)歸巢；在正常心肌區(qū)域，隨著t－AUCB干預濃度變大，正常心肌組織的EPCs細胞數(shù)雖有增多（組間P＜0．05），但各組差異不大，只有數(shù)個細胞，且歸巢至正常心肌細胞的細胞基數(shù)都不大，50個左右，提示在正常心肌，t－AUCB雖有作用，但明顯減弱；計數(shù)梗死心肌細胞時作者發(fā)現(xiàn)：隨著干預濃度逐漸增加，不同濃度t－AUCB干預的EPCs歸巢至梗死心肌細胞數(shù)明顯增加，各組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），但歸巢的細胞數(shù)均少，最多只有30個左右。

分析原因：（1）t－AUCB對外周培養(yǎng)的EPCs激活對歸巢具有刺激作用；（2）心肌方面，完整的心肌組織需要有完整的血管內(nèi)皮，開通的血管及活動的血流，以利于EPCs向心肌組織歸巢，此為EPCs順利歸巢的前提條件及重要影響因素。在梗死區(qū)，由于結(jié)扎冠脈中斷血流，EPCs經(jīng)靜脈進入小鼠后不能隨血流運行至梗死區(qū)；EPCs雖有遷移能力［11－13］，但心肌梗死后細胞腫脹、壞死，處于缺血缺氧環(huán)境，亦為EPCs向梗死心肌遷移提供障礙，心肌梗死后雖然有促進刺激EPCs歸巢的細胞因子分泌［14－15］，但抑制EPCs歸巢至梗死區(qū)的因素遠遠大于其促進因素，所以，經(jīng)外周靜脈注射的EPCs歸巢至梗死區(qū)域的細胞數(shù)少，而大量聚集在梗死心肌邊緣區(qū)域；在正常區(qū)域，雖然供應(yīng)心肌組織的血流沒有中斷，但缺少促進EPCs歸巢的細胞因子，所以，歸巢的細胞數(shù)介于上述兩區(qū)域之間。

綜上所述，從0～100μmol／L，隨著濃度增加，可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑t－AUCB進行性增強其正向調(diào)控EPCs歸巢功能。心肌梗死后歸巢至正常區(qū)域及梗死區(qū)域內(nèi)EPCs較少，正常區(qū)雖有差異，但差異較小，經(jīng)t－AUCB干預的EPCs主要歸巢至梗死心肌邊緣區(qū)域。所以，在后繼檢測t－AUCB干預EPCs對梗死心肌的影響研究時，研究對象只選取最有代表性的邊緣區(qū)，可明顯增加實驗的特異性及準確性。

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