人臍血間充質(zhì)干細胞移植與神經(jīng)節(jié)苷脂注射治療腦癱大鼠的對比研究

王麗敏，郭佳麗，楊自金，譚振香，田玉鳳，王超，盧思廣

人臍血間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UCBMSCs)具備來源豐富和多向轉(zhuǎn)化能力等特性，具有可觀的臨床研究和應用前景[1]。研究證實[2]，神經(jīng)節(jié)苷脂(gangliosides，GM1)對治療嬰幼兒腦癱(cerebral palsy,CP)有部分臨床療效，能改善CP患兒運動及認知功能,但UCBMSCs移植治療CP的基礎研究很少，本研究從臍血中分離培養(yǎng)MSCs并將其移植到CP鼠側(cè)腦室,觀察其神經(jīng)功能恢復及移植細胞的分化情況，觀察UCMSCs移植與GM1注射治療CP模型鼠的療效對比。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物及分組：隨機選取7d齡SD新生鼠制作缺血缺氧性CP模型80只、假手術(shù)20只，雌雄不限，分為假手術(shù)組、CP模型組、假移植組、MSCs移植組、GM1注射組，分別為5組各20只。②主要試劑：OrillCellTM細胞培養(yǎng)液，5-溴脫氧嘧啶尿苷(5-bromodeoxyuridine，Brdu)(Sigma)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記大鼠抗Brdu抗體(ABCAM)，PE標記膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibriliary acidic protein，GFAP)抗體(Millipore)，兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron marker NeuN，NSE)抗體(Abcam)，PE標記羊抗兔IgG-Cy3(Millipore)，GM1(齊魯制藥有限公司)，流式所用抗體(eBioscience)。③主要儀器：汪灣IC型動物腦立體定位儀， Olympus倒置相差顯微鏡IX-71，EUROSTAR III PLUS型熒光顯微鏡，F(xiàn)ACS Canto流式細胞儀。

1.2 方法 ①臍血MSCs的分離和培養(yǎng)：采集足月正常分娩胎兒臍血100ml,分離、提取單個核細胞，以1×106個/ml的細胞密度接種于含10%胎牛血清的OrillCellTM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。1周后更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細胞，以后換液3d/次，當細胞匯合度達到80%～90%時，進行擴增傳代。移植前72h加入Brdu 10μmol/L進行標記。移植前檢測細胞活力,調(diào)終濃度至1.0×105/10μl備移植用。②臍血MSCs的鑒定：收集第4代MSCs，制成濃度為1×106/ml的單細胞懸液，每個Eppendoff管加50μl細胞懸液，并分別加入小鼠抗人直標CD34、CD44、CD29、CD105、CD45各10μl，陰性對照管加FITC標記的兔抗鼠IgG及PE標記的兔抗鼠IgG各10μl，4℃孵育30min后用流式細胞儀分析細胞表面抗原。③CP造模：受孕17d孕鼠腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)0.4mg/(kg·d) ，連續(xù)注射2d，孕鼠自體分娩，生后4周通過進行握持牽引試驗時間、足錯誤試驗行為學評價及病理檢查[3]，篩選CP模型動物80只。④CP模型側(cè)腦室移植：對CP模型進行麻醉并固定在立體定位儀，作頭皮矢狀切口，定位注射部位，鉆孔。注射部位為左側(cè)側(cè)腦室：AP=-3mm，ML=-1.5mm，DV=-4mm。 MSCs移植組:向每個注射點注射10μl細胞懸液(細胞數(shù)約為1×105個/10μl)，GM1注射組與假移植組移植部位相同，分別注射相同容積的GM1溶液(含GM120μg)、PBS液。

1.3 評定標準 ①行為學評價：包括握持牽引試驗及足錯誤試驗[4]，握持牽引實驗：大鼠用前爪抓住離地面45cm水平放置的直徑0.6cm的空心塑料管懸掛，記錄其懸掛時間(最大值為60s，超過60s按60s計算)；足錯誤實驗：記錄大鼠在水平放置的網(wǎng)格上(50cm×40cm，每格3cm×3cm)2min內(nèi)前、后肢或爪子掉下來的次數(shù)，為排除不同大鼠活動度差別的影響，只將左右側(cè)錯誤次數(shù)的差值進行統(tǒng)計分析。②伊紅(HE)染色檢查：腦組織HE染色檢查是行為學測后進行，隨機取CP組和假手術(shù)組幼鼠各2只，作腦組織切片HE染色，觀察腦組織形態(tài)學變化。③免疫組織化學分析：于移植后1W、2W、3W移植組隨機取2只，取腦組織(方法同前)，制作石蠟切片，片厚3μm做腦組織免疫組織熒光，計數(shù)同一部位Brdu陽性細胞數(shù)，計算其平均值。其余大鼠均在28d進行功能測試后處死，檢測移植細胞GFAP標志及NSE標志，隨機計數(shù)20個視野，計算平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 臍血MSCs的分離純化 分離純化的單核細胞培養(yǎng)24h后出現(xiàn)貼壁細胞生長,原代細胞生長較為緩慢，更換培養(yǎng)液后細胞增長較快,逐漸生出較長的突起,呈長梭形,少部分呈多角形，單個核，折光較強。細胞達到80%～90%融合度時,進行傳代培養(yǎng),細胞增殖較原代細胞迅速,隨時間的延長扁平圓形細胞逐漸消失,到第3代后細胞為形態(tài)較為單一、長梭形、單核的成纖維樣細胞。見圖1。

2.2 臍血MSCs的鑒定 細胞傳4代后，應用流式細胞儀進行面標志性抗原檢測，結(jié)果顯示臍血MSCs高表達抗原標記CD13、CD44和CD105表面標志,低表達CD34和CD45表面標志。

2.3 細胞免疫熒光結(jié)果 Brdu標記臍血MSCs 72h后，細胞爬片后，應用直接免疫熒光法檢測Brdu陽性細胞率，大部分細胞核被染成鮮綠色，結(jié)果為93%，說明標記成功。見圖2。

2.4 行為學評價 移植4周后，各組握持時間比較：假手術(shù)組較CP組握持時間明顯延長(P<0.05)；假移植組與CP組比較差異無統(tǒng)計學意義；MSCs移植組握持時間長于GM1注射組(P<0.05)，GM1注射組又長于CP組(P<0.05)。足錯誤次數(shù)比較:CP組較假手術(shù)組錯誤次數(shù)明顯增多(P<0.05)；假移植組與CP組錯誤次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義；MSCs移植錯誤次數(shù)少于GM1注射組(P<0.05)，GM1注射組又少于CP組(P<0.05)。見表1。

2.5 HE染色病理檢查 術(shù)后3周，取腦組織做病理檢查，大腦出現(xiàn)不同程度的出血，細胞腫脹,部分神經(jīng)細胞變性壞死,周圍炎細胞浸潤，左半球較右半球嚴重，血管內(nèi)可見血栓形成。見圖3。

2.6 MSCs移植組大鼠腦內(nèi)免疫組化 臍血MSCs移植后1、2、3周,大鼠腦組織切片均可見Brdu陽性細胞分布，以左側(cè)側(cè)腦室、額葉、頂葉皮質(zhì)及白質(zhì)較為密集，缺血側(cè)Brdu陽性移植細胞數(shù)明顯多于對側(cè)。移植后第1周，Brdu陽性細胞以注射部位即左側(cè)側(cè)腦室為主，移植后第2周、3周左側(cè)側(cè)腦室Brdu陽性細胞逐漸減少，并逐漸向大腦皮質(zhì)及白質(zhì)、額葉、頂葉遷移。見表2、圖4，5。第4周利用免疫熒光法檢測移植細胞的GFAP標志及NSE標志，結(jié)果顯示：(0.45±0.68)個MSCs表達GFAP,(0.15±0.36)個MSCs表達NSE，如圖6。

表1 各組牽引實驗及足錯誤實驗結(jié)果比較

與CP組比較，aP<0.05；與GM1注射組比較,bP<0.05

表2 MSCs移植組Brdu陽性細胞數(shù) 個/視野,

圖1 第3代細胞，形態(tài)較為單一、長梭形、單核的成纖維樣細胞(×40)圖2 細胞標記后Brdu免疫熒光(×400)

圖3 手術(shù)3周后HE染色顯示大腦血管內(nèi)有液栓形成(×200)圖4 MSCs移植第1周，左側(cè)腦室Brdu陽性細胞(×200)

圖5 MSCs移植第2周，遷移到額葉的FITC標記的Br?du陽性細胞(×200)圖6 MSCs移植第4周，側(cè)腦室PE標記的GFAP陽性細胞(×200)

3 討論

迄今,臨床上對CP患兒多采取支持和對癥的治療方法，尚未研究出徹底有效的治療方案[5]。因此,CP患兒的功能恢復問題已成為世界各國科研機構(gòu)研究的熱點和難點。目前CP模型制作方法有3種：缺血缺氧因素所致CP模型、宮內(nèi)感染因素所致CP模型、膽紅素所致CP模型，第一種方法操作簡單，易成功，后兩種方法操作相對復雜，成功率相對低，主要是注射劑量的把握。本實驗連續(xù)2d腹腔注射LPS，幼鼠出生后死亡較多，但成活的早產(chǎn)鼠符合CP標準的較多，與報道略不同[4]，可能與注射劑量偏大有關(guān)。

本實驗在MSCs移植后第4周，通過腦組織免疫熒光法分別檢測GFAP及NSE來觀察移植細胞在大鼠腦組織內(nèi)的分化情況，實驗結(jié)果提示MSCs移植后可以分化為GFAP和NSE，但細胞分化神經(jīng)元樣細胞比例低，考慮與檢測時機較早有關(guān)，選取合適的檢測時間窗需要進一步的實驗研究；目前有在體外一定誘導條件下，將MSCs誘導分化為相應組織細胞后再移植入人體內(nèi)的相關(guān)報道，但經(jīng)誘導分化的MSCs的細胞特性是否被改變,是否有發(fā)展為腫瘤可能?這些問題需要進一步研究。

本實驗是研究MSCs移植與GM1注射治療CP療效的對比，MSCs移植對于CP鼠神經(jīng)功能的恢復具有良好的促進作用,雖然其作用機制尚不完全明確，但目前認為可能機制包括：①MSCs在局部微環(huán)境的刺激下,向受損組織細胞分化并替代受損細胞有關(guān)[6]，這可能為移植后Brdu陽性細胞數(shù)逐漸減少的原因之一，因此如何減少移植細胞的凋亡，使移植細胞更持久得存活在移植物體內(nèi)，是保證細胞移植療效的關(guān)鍵，又是一個研究難題，本實驗是將MSCs一次性移植CP鼠左側(cè)側(cè)腦室，是否定期、定量、多注射點的移植方法效果更好些，待進一步研究；②可能與干細胞通過自分泌的形式產(chǎn)生各種細胞因子有關(guān)。研究證實，MSCs能分泌IL-6、IL-11、TPO、SCF、FLT-3及LIF等多種細胞因子[7]，這些細胞因子參與腦組織的可塑性，如血管神經(jīng)的再生及突觸的發(fā)生[8-9]，這可能正是MSCs改善CP鼠神經(jīng)功能恢復的作用機制，有待進行進一步研究；③增殖分化成神經(jīng)樣細胞，如星形膠質(zhì)細胞，星形膠質(zhì)細胞可以清除腦脊液中的碎片和毒素、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和離子濃度及分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等，從而維持神經(jīng)元正常運行所需的內(nèi)環(huán)境[10]。GM1改善CP大鼠的神經(jīng)功能恢復，其作用機理可能是通過：①通過抑制NO合酶以減少過量NO的生成；②調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子或與其結(jié)合，為其發(fā)揮作用提供良好的環(huán)境[11]；③GW1易通過血-腦屏障嵌入到損傷的神經(jīng)細胞膜，從而穩(wěn)定細胞膜的結(jié)構(gòu)，維持細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶的生物活性,進而起到維持細胞內(nèi)外離子的平衡、防止細胞內(nèi)Ca2+的積聚及減輕神經(jīng)細胞水腫；④GW1對神經(jīng)組織具有高度的特異親和力，能夠促進神經(jīng)元的萌發(fā)突起，GW1可以擴張血管，提供充足的能量和營養(yǎng)，以促進多損神經(jīng)細胞的修復和再生[12]。本實驗通過分別對MSCs移植組及GM1注射組的CP大鼠進行行為學評價，結(jié)果顯示MSCs移植比GM1注射使大鼠握持時間更長，足錯誤次數(shù)更少，能更好地提高CP大鼠神經(jīng)功能的恢復，但遠期效果如何需要更進一步的研究。

MSCs具有低免疫原性，不易被HLA不相容受體識別，故MSCs細胞可應用于異源性或異種的移植治療，臍血MSCs移植為神經(jīng)系統(tǒng)損傷或發(fā)育缺陷疾病提供了廣闊的治療前景，極大地推動了神經(jīng)系統(tǒng)的細胞治療，開辟了神經(jīng)系統(tǒng)治療的新領(lǐng)域，具有重要的臨床應用價值和前景,與此同時，也面臨很多難題，故臍血MSCs移植治療CP，從基礎實驗向臨床應用實踐的邁進需要一個漫長的研究探索過程。

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