電針豐隆穴對(duì)高脂血癥大鼠血脂及肝臟組織炎癥細(xì)胞因子的調(diào)控作用

樂(lè)薇，張紅星，王瓊，黃國(guó)付，周利，覃鵬飛

高脂血癥是指由于機(jī)體脂類代謝失調(diào)而導(dǎo)致血液中一種或幾種脂質(zhì)或成分明顯異常。高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化形成的危險(xiǎn)因素之一，脂質(zhì)在血管內(nèi)皮沉積而引起動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生冠心病和周?chē)懿∽?，機(jī)體炎癥在此類疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。近幾年非藥物療法治療高脂血癥受到重視，尤其是臨床應(yīng)用針刺療法治療高脂血癥，有了較大的進(jìn)展，療效也較為顯著，顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察電針豐隆穴對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的蛋白水平變化的影響，明確電針通過(guò)抑制促炎反應(yīng)從而達(dá)到對(duì)高脂血癥的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量180～200g，由湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為[SCXK(鄂) 2008-0004]。②主要試劑與儀器：大鼠TNF-α、 IL-1β、IFN-γ的ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)，OLYMPUS AU2700型全自動(dòng)生化分析儀(日本OLYMPUS公司)，LH202H型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華威有限公司)，32#1寸健衛(wèi)士牌不銹鋼針灸針(長(zhǎng)25mm，直徑0.25mm，型號(hào)S3210，中美合作泰成科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法 ①分組及處理：30只大鼠隨機(jī)分為3組：正常組、模型組、電針組，每組10只大鼠。正常組：普通飼料喂養(yǎng)8周，期間不予任何治療；模型組：高脂飼料喂養(yǎng)4周，造模成功[2]+高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)4周，期間不予任何治療；電針組：高脂飼料喂養(yǎng)4周，造模成功+(高脂飼料+電針豐隆穴)4周。②造模：模型組、電針組大鼠用高脂飼料(豬油10%，蛋黃粉5%，膽固醇1%，丙基硫氧嘧啶0.2%，脫氧膽酸鈉0.5%，蔗糖5%，基礎(chǔ)飼料78.3%)喂養(yǎng)[3]。③治療方法：取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]，選取雙側(cè)豐隆穴，模擬人體經(jīng)穴定位。豐隆穴在大鼠膝關(guān)節(jié)外側(cè)后三里下1mm，腓骨小頭下約5mm 處。用32#1寸針灸針，對(duì)豐隆穴直刺7mm，快速捻轉(zhuǎn)至針下沉澀感后，接韓式穴位神經(jīng)刺激儀，等幅疏密波，頻率為2～100Hz，電流強(qiáng)度2mA，以動(dòng)物肢體微顫為度，每次治療30min，每天1次，連續(xù)30d。常規(guī)溫度、濕度及統(tǒng)一飲水喂養(yǎng)。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) ①所有大鼠通過(guò)腹主動(dòng)脈采血4～5ml，送我院檢驗(yàn)科，采用全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)血漿中總膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量。②ELISA檢測(cè)大鼠肝臟組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的蛋白水平變化：將大鼠肝臟組織加入適量生理鹽水搗碎，然后1000r/min離心10min，取上清液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中各加入100μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，第1孔中加入1000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品100μl，混勻后從第1孔中用加樣器吸出100μl移至第2孔，混勻后用加樣器再吸出100μl 移至第3孔，如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第5孔，最后，從第7孔中吸出100μl棄去，使之體積均為100μl。第8孔為空白對(duì)照，在反應(yīng)板待測(cè)品孔中，每孔各加入待測(cè)樣品100μl；將反應(yīng)板充分混勻后置37℃孵育120min；用稀釋20倍后的洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，放濾紙上印干；標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)品孔中各加入第一抗體工作液50μl；將反應(yīng)板置37℃孵育60min，洗板，每孔各加入酶標(biāo)抗體工作液100μl；將反應(yīng)板置37℃ 60min；洗板；每孔各加底物工作液100μl，并將反應(yīng)板置37℃暗處5～10min；每孔各加入50μl(1滴)終止液混勻；在492nm 處測(cè)吸光值(OD450)。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫軸，OD值為縱軸在半對(duì)數(shù)紙上作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品之OD值在該曲線上查出相應(yīng)蛋白含量。

2 結(jié)果

治療30d后，各組大鼠血脂水平比較，與正常組比較，模型組大鼠TC、TG及LDL-C均顯著升高(P<0.01，0.05)，HDL-C顯著降低(P<0.05)；與正常組比較，電針組的TC、LDL-C均顯著升高(P<0.01)，TG、HDL-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，電針組大鼠TC、TG及LDL-C均顯著降低(P<0.01，0.05)，HDL-C顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

各組大鼠肝臟組織炎癥因子蛋白水平比較，與正常組比較，模型組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ均有顯著性升高(P<0.05，0.01)。與正常組比較，電針組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，電針組炎癥因子均有明顯降低(P<0.05，0.01)。見(jiàn)表2。

組別nTCTGHDL-CLDL-C正常組101.58±0.360.49±0.210.88±0.280.23±0.07模型組1011.05±3.01b0.68±0.19a0.62±0.19a5.34±1.11b電針組104.89±0.81bd0.51±0.17c0.78±0.12c1.15±0.28bd

與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

組別nTNF-αIL-1βIFN-γ正常組10320.65±101.68101.33±55.32141.85±87.66模型組10890.37±109.89b340.47±67.68b267.89±89.73a電針組10416.32±102.86d159.31±68.57d179.21±87.89c

與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

3 討論

高脂血癥是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的名詞，中醫(yī)學(xué)并無(wú)高脂血癥的病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)將其歸入“眩暈”、“胸痹”、“血瘀”、“痰濕”等病證范疇[5]。中醫(yī)學(xué)對(duì)于高脂血癥的認(rèn)識(shí)源于《內(nèi)經(jīng)》的“膏脂學(xué)說(shuō)”，膏源于水谷，屬津液之一，并能化入血中，是人體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，脂亦源于水谷，為津液中之精微，過(guò)多的脂則形成膏。針灸療法對(duì)脂質(zhì)及脂蛋白的代謝具有良性的雙向調(diào)節(jié)作用，豐隆穴是經(jīng)過(guò)臨床檢驗(yàn)的能調(diào)節(jié)血脂水平的有效經(jīng)驗(yàn)用穴[6]。豐隆穴屬足陽(yáng)明胃經(jīng)的絡(luò)穴，可以聯(lián)絡(luò)胃、脾二經(jīng)。因此針刺該穴具有“一絡(luò)通二經(jīng)”之效，能疏通表里兩經(jīng)之氣血，和胃健脾、化痰利濕，為祛痰要穴。

膽固醇是人體生命活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與構(gòu)成細(xì)胞膜，也是合成體內(nèi)激素的重要成分之一[7]。HDL-C將各組織中的膽固醇轉(zhuǎn)送到肝臟進(jìn)行代謝，而LDL-C的作用是將膽固醇從肝臟運(yùn)送至全身組織。當(dāng)LDL-C過(guò)量時(shí)，它攜帶的膽固醇便積存在動(dòng)脈血管壁上，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，因此LDL-C也被稱為“壞的膽固醇”[8]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)8周后，模型組大鼠血脂各項(xiàng)指標(biāo)較正常組均有明顯差異性，表明較長(zhǎng)時(shí)間的高脂飲食導(dǎo)致大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，具有嚴(yán)重的危害性。電針組的TG、HDL-C與正常組比較沒(méi)有顯著差異性，而且其與模型組比較大鼠血脂各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯差異性，說(shuō)明電針豐隆穴能顯著降低TC、LDL-C的水平，促進(jìn)膽固醇從外周組織轉(zhuǎn)送至肝臟，對(duì)治療高脂血癥具有非常顯著性的效果。

大量研究數(shù)據(jù)表明[9]，長(zhǎng)期血脂代謝異常會(huì)導(dǎo)致單核/巨噬細(xì)胞的數(shù)量增多，加劇血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，脂質(zhì)代謝清除障礙，這就是炎癥的起始階段。IFN-γ最初叫巨噬細(xì)胞活化因子，可介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的激活，促進(jìn)IL-1、6、8，TNF-a等炎癥因子的分泌。TNF-α是介導(dǎo)肝臟損傷的主要因子，在肝臟脂質(zhì)代謝障礙中扮演了重要角色[10]。研究表明TNF-α可降低胰島素對(duì)其受體的誘導(dǎo)活化，下調(diào)胰島素受體、過(guò)氧化酶體增殖物激活受體-γ等的表達(dá)[11]，從而影響葡萄糖和脂肪的代謝。高濃度的TNF-α可減少外周組織脂肪分解，并促進(jìn)肝細(xì)胞TG的合成及聚集，從而加速肝臟脂肪沉積的進(jìn)程。IL-1β作為炎癥細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)激活的巨噬細(xì)胞分化和浸潤(rùn)，還能可以上調(diào)黏附分子和其他細(xì)胞因子的表達(dá)，從而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)[12-13]。

本試驗(yàn)顯示，與正常組比較，模型組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ均有顯著性升高，提示高脂血癥模型大鼠處于炎癥狀態(tài)，炎癥因子的表達(dá)與血脂水平呈正相關(guān)表明血脂異常、炎癥反應(yīng)之間存在著相互誘導(dǎo)、相互協(xié)同的密切關(guān)系。

國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)他汀類降脂藥物具有參與對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能的調(diào)控、抑制炎癥反應(yīng)等降脂以外的作用[14]。從本次試驗(yàn)結(jié)果：電針組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ較正常組均無(wú)顯著差異性；而與模型組比較，電針組炎癥因子均有明顯降低。因此，我們可以推論出針刺豐隆穴能有效抑制促炎癥因子的釋放，通過(guò)減輕高脂血癥所引發(fā)的機(jī)體內(nèi)環(huán)境的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，能在一定程度上減緩高脂血癥疾病的進(jìn)展，達(dá)到調(diào)節(jié)血脂的目的，對(duì)臨床上針刺豐隆穴治療高脂血癥疾病的有效性提供理論支持。

[1] 張?zhí)品ǎf(wàn)文俊，張紅星，等.電針豐隆穴治療高脂血癥的多中心觀察[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(9)：17-19.

[2] 王瓊，樂(lè)薇，覃鵬飛，等．三種高脂血癥實(shí)驗(yàn)性大鼠模型的比較[J].中國(guó)康復(fù)，2010，25(5)：330-331.

[3] 張紅星，王瓊，樂(lè)薇，等.高脂血癥大鼠模型建立的動(dòng)態(tài)研究[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(1)：19-22.

[4] 鄧春雷，殷克敬.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1998，147-148.

[5] 孫麗英，焦亞斌，康廣盛.高脂血癥的病因病機(jī)研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2004，32(2)：70-71.

[6] 張紅星，張?zhí)品?，蔡?guó)偉.中醫(yī)學(xué)對(duì)高脂血癥病因病機(jī)及針刺豐隆穴治療高脂血癥的認(rèn)識(shí)[J].中國(guó)老年病雜志，2006，3(3)：138-139.

[7] 蔡曼波，李建軍，胡麗，等.NO-1886對(duì)高脂/高糖/高膽固醇飼養(yǎng)的小型豬組織中腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素1β蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2011，19(9)：741-746.

[8] 陸再英，鐘南山.內(nèi)科學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社,2008，267-274.

[9] 余敏，肖曉秋，唐成林，等.不同強(qiáng)度電針對(duì)肥胖大鼠血脂、脂肪組織巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1及腫瘤壞死因子-α的影響[J].針刺研究，2011，36(2)：79-84.

[10]Siasos G， Tousoulis D， Oikonomou E， et al．Inflammatory markers in hyperlipidemia：from experimental models to clinical practice[J]．Curr Pharm Des，2011，17(37)：4132-4146.

[11]Ruan H，Hacohen N，Golub TR，et al．Tumor necrosis factor-alpha suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in3T3-L1 adipocytes：nuclear factor-kappaB activation by TNF-alpha is obligatory[J]．Diabetes,2002,51(5)：1319-1936.

[12]馬雅荃，王蓓蓓，韓俊燕，等. 高脂血癥對(duì)炎性免疫應(yīng)答的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版)，2013，7(4)：7-10.

[13]余再新，彭道地，劉瓊，等．冠心病患者血清TNF-α和Cys C的水平及血塞通的影響[J]．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(10):1529-1532．

[14]Rosenson RS，Tangney CC. Antiathrothrombotic properties of statin：implications for cardiovascular event reduction[J]．JAMA，1998，279(20)：1643-1647.