耐鎘菌株的篩選及生物學(xué)特性

許欽坤　趙翠燕

摘要：從污染土壤中，分離出1株能高度抗鎘和吸附鎘的菌株S-1，經(jīng)初步鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該菌株在液體細(xì)菌培養(yǎng)基中耐鎘（Cd）濃度高達(dá)600 mg/L；菌株S-1對(duì)Cd2+有較好的吸附效果，吸附率高達(dá)75.4%。

關(guān)鍵詞：篩選；耐鎘菌株；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)： X131.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0317-02

收稿日期：2014-04-02

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃（編號(hào)：2011B010500018）；廣東省韶關(guān)市科技計(jì)劃（編號(hào)：313-140513）。

作者簡(jiǎn)介：許欽坤（1977—），男，山東單縣人，碩士，講師，主要從事資源微生物利用研究。

通信作者：趙翠燕。E-mail：bethzhao2003@163.com。鎘（Cd）是嚴(yán)重危害人類健康的重金屬元素，極微量就會(huì)對(duì)人體造成危害，鎘進(jìn)入人體后，可對(duì)腎臟、骨骼、肺部、心血管等器官造成危害。許多農(nóng)村、城市的土壤和水資源受到不同程度的鎘污染，用受污染的水灌溉時(shí)，可使灌區(qū)和下游地區(qū)的農(nóng)作物受鎘污染，并富集于農(nóng)作物中，從而進(jìn)一步危害人體健康。另外，自然環(huán)境一旦被鎘污染，消除其影響是很困難的。生物修復(fù)技術(shù)是重金屬污染土壤治理的重要手段之一，具有處理費(fèi)用低、對(duì)環(huán)境影響小、效率高等優(yōu)點(diǎn)，目前，利用微生物進(jìn)行重金屬污染土壤的修復(fù)是近幾年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。微生物是通過(guò)代謝活動(dòng)及其產(chǎn)物來(lái)促進(jìn)重金屬的溶解，從而提高重金屬在土壤中的生物有效性[1]，微生物還能促進(jìn)植物旺盛生長(zhǎng)，增大植物生物量，通過(guò)強(qiáng)化植物來(lái)修復(fù)重金屬污染土壤。本研究從鎘污染土壤中分離耐鎘細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行初步研究，以期為該細(xì)菌在鎘污染治理中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1土壤樣品采自廣東某鉛鋅礦區(qū)周圍土壤。

1.1.2培養(yǎng)基和試劑牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨6 g、NaCl 3 g、瓊脂粉12.0 g、水600 mL，pH值為7.0～7.2；液體培養(yǎng)基：不加瓊脂的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基：在固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，加人不同濃度的Cd2+溶液。硝酸鎘、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等試劑，化學(xué)純，均為國(guó)產(chǎn)；細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等，均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；Goldview，購(gòu)于廣州瑞真公司。

1.1.3主要儀器手提式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；MAKE KA-1000型低速離心機(jī)，海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌種的培養(yǎng)及分離純化試驗(yàn)選用稀釋平板法[2]，在無(wú)菌條件下，將一定量的土樣放入一定體積的無(wú)菌水中，用移液管反復(fù)吹洗，直至顆粒狀樣品打散，搖勻，分別配制10-2、10-3、10-4、10-5菌懸液；分別吸取0.1 mL菌液，置于含有40 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)，涂布均勻，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待長(zhǎng)出菌落后，挑取光滑透明、濕潤(rùn)的單菌落劃線分離，在37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，獲得其純培養(yǎng)；進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到含有100 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，選用長(zhǎng)勢(shì)較好的菌作斜面，4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2菌株常規(guī)生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[3]，對(duì)菌株進(jìn)行系列生理生化特性試驗(yàn)，主要包括甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基醇試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)及吲哚試驗(yàn)等，每組2個(gè)平行。

1.2.3耐鎘菌株16S rRNA 基因序列分析將篩選到的菌株接種到培養(yǎng)基平板上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取單菌落到液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)過(guò)夜；用細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒提取總DNA為模板，進(jìn)行16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增，所用引物為27 F ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R1492：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′[4]。PCR總反應(yīng)體系為：10×buffer 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，dNTPs 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，去離子水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取 5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，由上海生工公司測(cè)序；將16S rDNA的測(cè)序結(jié)果輸入基因庫(kù)（GenBank）進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.4菌株對(duì)鎘的耐受性配制含Cd2+濃度分別為0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液；將斜面保存的菌株在無(wú)鎘液體培養(yǎng)基中活化24 h，以2%接種量接入培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.2.5菌株對(duì)鎘的吸收性能將斜面保存的菌株轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；吸取菌液 0.5 mL 接入50 mL滅菌、含Cd2+100 mg/L的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，以不加菌株、直接加入0.5 mL無(wú)菌水為對(duì)照培養(yǎng)基，于37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h；細(xì)菌懸浮液經(jīng)12 000 r/min離心5 min，取其上清液；用原子吸收儀測(cè)定上清液中鎘的濃度，計(jì)算菌株對(duì)培養(yǎng)液中有效鎘的吸附率：吸附率=（C0-C1）/C0×100%，式中，C0為對(duì)照的鎘濃度（mg/L ），C1為吸附后上清液的鎘濃度（mg/L）[5]。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2結(jié)果與分析endprint

2.1耐鎘菌株的篩選

從含Cd2+100 mg/L的培養(yǎng)基中分離得到1株耐鎘細(xì)菌，菌落乳白色，表面粗糙，不透明，經(jīng)革蘭氏染色呈陰性；菌體桿狀，命名為S-1。經(jīng)生理生化試驗(yàn)分析，結(jié)果表明，菌株S-1甲基紅、乙酰甲基甲醇、淀粉酶、過(guò)氧化氫酶、明膠液化試驗(yàn)檢測(cè)均呈陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)檢測(cè)呈陰性。

利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1 500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。Blast比對(duì)分析顯示，菌株S-1與Bacillus cereus AF290547的16S rDNA 序列同源性高達(dá)97%，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，表明 S-1菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.2菌株對(duì)鎘的耐受性

菌株S-1在含Cd2+濃度范圍0～200 mg/L的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好；Cd2+濃度超過(guò)300 mg/L時(shí)，菌株S-1的生長(zhǎng)受到抑制；當(dāng)Cd2+濃度增加到超過(guò)700 mg/L時(shí)，菌株S-1的生長(zhǎng)完全被抑制。這說(shuō)明菌株S-1對(duì)Cd2+的最大耐受濃度為600 mg/L。

2.3菌株對(duì)鎘的吸收性能

菌株S-1在含Cd2+100 mg/L的培養(yǎng)基37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，離心，收集上清液，過(guò)原子吸收儀測(cè)定上清液中Cd2+的濃度，結(jié)果表明，菌株S-1對(duì)Cd2+的吸附率為75.4%。

3結(jié)論

試驗(yàn)篩選到1株耐鎘菌株S-1，經(jīng)生理生化試驗(yàn)和16S rRNA序列分析，鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）；菌株S-1的Cd2+最大耐受濃度為600 mg/L，對(duì)Cd2+的吸附率為75.4%。菌株S-1對(duì)鎘具有較強(qiáng)的抗性和富集能力，在鎘污染治理中有良好的應(yīng)用前景。

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