辛芩減方對豚鼠變應(yīng)性鼻炎的藥效學(xué)研究＊

唐 勤，邢 茂，胡長鵬，黃景彬，張 蓉

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院藥劑科，重慶400037）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis）是鼻炎中常見的類型，臨床上常伴有鼻癢、打噴嚏、流清涕等癥狀[1]，給患者的生活帶來很大的不便。近年來變應(yīng)性鼻炎全球發(fā)病率為17%，但近30%的人都受到變應(yīng)性鼻炎（AR）的影響[2-4]，嚴(yán)重威脅著人們的生存和生活質(zhì)量。中藥辛芩方是由細辛、黃芩、荊芥、防風(fēng)、白芷、蒼耳子、黃芪、白術(shù)、桂枝、石菖蒲10味藥組成，能益氣固表，祛風(fēng)通竅。以該方為基礎(chǔ)的中藥制劑在治療變應(yīng)性鼻炎方面均有很好的療效[5-7]。但辛芩方中含有微量馬兜鈴酸，自馬兜鈴酸事件后，該物質(zhì)對腎臟的毒性在世界范圍內(nèi)取得共識。因此本實驗欲去掉辛芩方中毒性藥材細辛，研究辛芩減方對變應(yīng)性鼻炎的治療作用，旨在保證中藥治療作用的同時減少其潛在毒副作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 甲苯-2，4-二異氰酸酯（TDI，sigma，批號：SHBD198V）；豚鼠組胺試劑盒（武漢優(yōu)爾生，批號：L140312255）；氯雷他定（上海先靈葆雅制藥有限公司，批號：11JRXF1039）；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定所，批號：110715-201117）；馬兜鈴酸對照品（中國食品藥品檢定所，批號：110748-201309）；甲醇（Honeywell，色譜純，批號：N2TG1H）；羥甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：F20060125）；多聚甲醛（天津市光復(fù)精細化工研究所，批號：50116）。

1.1.2 實驗儀器 美國Agilent1200系列高效液相色譜法（HPLC）（G1322A在線真空脫氣機，G1311A四元梯度泵，G1329A自動溫控進樣器，G1316A柱溫箱，G1314B紫外檢測器）；ME235型電子分析天平（德國賽多利斯）；LB30S顯微鏡（德國萊卡）。

1.1.3 實驗動物 豚鼠（300±50）g，雄性，50只，動物飼養(yǎng)于清潔級，動物飼養(yǎng)許可證號：豚鼠SYXK（渝）2012-0011。

1.2 方法

1.2.1 辛芩全方及減方浸膏的制備 按照辛芩處方和減方各藥的比例，稱取各藥50g，加入8倍量的水浸泡0.5h。煎煮2次，第1次1.5h，第2次1.0h，煎液濾過，濾液合并，濃縮至一定體積，真空干燥，得干浸膏，置于干燥器中備用[6]。全方和減方的浸膏回收率分別為（22.32±0.45）%和（21.73±1.34）%。

1.2.2 辛芩全方及減方中黃芩苷的含量測定

1.2.2.1 浸膏提取物的前處理[8]取浸膏約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%的乙醇50mL，密塞，稱定質(zhì)量。超聲處理30min，放冷，稱定質(zhì)量，70%的乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.2 黃芩苷HPLC定量檢測方法 色譜條件：Phenome-nex Luna C18色譜柱（250.0mm×4.6mm，5μm）；檢測波長為278nm；進樣量10μL；柱溫30℃；以甲醇為流動相A，0.2%的磷酸為流動相B；梯度洗脫條件：0～10min（51%A），10～13min（51%→70%A），13～18min（70%A），18～20min（70%→51%A），20～22min（51%A）。

1.2.3 辛芩全方及減方中馬兜鈴酸含量測定

1.2.3.1 浸膏提取物的前處理[8]取浸膏約5.0g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%的甲醇25mL，密塞，稱定質(zhì)量。超聲處理30min，放冷，稱定質(zhì)量，70%的甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3.2 馬兜鈴酸HPLC檢測方法[9]色譜條件：Phenomenex Luna C18色譜柱（250.0mm×4.6mm，5μm）；檢測波長為250nm；進樣量20μL；流動相甲醇-1%冰醋酸（70∶30）；流速1mL／min；柱溫30℃。

1.2.4 變應(yīng)性鼻炎模型的建立 參照《中藥藥理實驗方法學(xué)》中動物病理模型的建立方法[10-11]，豚鼠35只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d。除健康對照組（7只）外，其余動物每日經(jīng)雙側(cè)鼻腔滴入10%甲苯-2，4-二異氰酸酯（TDI）橄欖油溶液，每側(cè)5μL，每日1次，連續(xù)7d，空白組每日滴入同體積的橄欖油。于第7天滴鼻后，觀察經(jīng)激發(fā)后15.0min內(nèi)豚鼠鼻部局部癥狀，并記錄豚鼠抓鼻、噴嚏和流清涕的次數(shù)與嚴(yán)重程度。抓鼻：輕抓鼻1～2次為1分，劇烈抓鼻四周為2分；噴嚏：1～3個為1分，4～10個為2分，11個以上為3分；流涕：流到前鼻孔為1分，超過前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。評分結(jié)果大于5分者，造模成功。

1.2.5 分組與給藥 取造模成功的豚鼠28只，隨機分為模型組、氯雷他定組（1mg／kg）、辛芩減方組（1.8g／kg）和辛芩全方組（2.1g／kg）。各組豚鼠灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14d，模型組和空白組給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）。給藥期間，甲苯二異氰酸酯（TDI）改為給藥后1.0h滴鼻，隔日刺激。

1.2.6 鼻部過敏癥狀記錄 灌胃給藥結(jié)束后，采用盲評法記錄TDI刺激后15.0min內(nèi)抓鼻、噴嚏的次數(shù)，并與給藥前抓鼻和噴嚏次數(shù)相比較，研究對鼻部過敏癥狀的改善情況。

1.2.7 血清中組胺的檢測 灌胃給藥后，將豚鼠用10%的水合氯醛麻醉，股動脈取血。靜置2.0h，3 000r／min離心10 min，取血清，分裝后置于-80℃超低溫冰箱中。按照ELISA試劑盒說明書，檢測血清中組胺的含量。

1.2.8 鼻黏膜形態(tài)學(xué)觀察 灌胃給藥結(jié)束麻醉后，剝除上頜骨部皮膚并將上頜骨從顱骨中游離出來，沿鼻中線切開，暴露鼻中隔及雙側(cè)鼻腔，將鼻中隔前中段剪下，取鼻中隔兩側(cè)的鼻黏膜組織固定在10%的多聚甲醛中，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡觀察鼻黏膜的形態(tài)及嗜酸性粒細胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用±s表示，采用方差分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷含量 按以上色譜條件分別檢測黃芩苷對照品（62.48μg／mL）、辛芩全方浸膏、辛芩減方浸膏的色譜行為。在該條件下，黃芩苷色譜峰如箭頭所示，保留時間為8.7min，理論塔板數(shù)5 700，分離度為4.8。該條件符合辛芩方中黃芩苷的檢測，其色譜圖見圖1。

圖1 HPLC檢測黃芩苷含量系統(tǒng)適應(yīng)性實驗圖譜

按照方法學(xué)考察要求，對線性、回收率，以及重復(fù)性實驗進行考察，均符合要求，表明該方法分離度好、穩(wěn)定，可用于方中黃芩苷的檢測。按照浸膏前處理的方法，采用HPLC法檢測浸膏中黃芩苷的含量，在三批次樣品中辛芩全方及減方中黃芩苷的平均含量分別為（13.16±0.05）和（14.33±0.45）μg／mg，兩方之間的黃芩苷含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 辛芩全方及減方浸膏中黃芩苷的含量（±s，μg／mg）

表1 辛芩全方及減方浸膏中黃芩苷的含量（±s，μg／mg）

批次 辛芩全方 辛芩減方1 12.67±0.08 13.90±0.44 2 13.14±0.13 14.29±0.47 3 13.68±0.02 14.80±0.20平均值13.16±0.05 14.33±0.45

2.2 馬兜鈴酸的含量 按照1.2.3項下的前處理方法及色譜條件分別檢測馬兜鈴酸對照品（16.4μg／mL）、辛芩全方浸膏以及減方浸膏的色譜行為，該方法的理論塔板數(shù)10 188。該條件下各樣品色譜圖見圖2。

從色譜圖中可以看到，馬兜鈴酸的保留時間為10.2min（A），辛芩全方在10.2min有馬兜鈴酸的峰（B），減方中未檢測到馬兜鈴酸（C）。初步含量測定結(jié)果表明，辛芩方浸膏中的馬兜鈴酸的含量為0.000 1%，低于藥典規(guī)定的0.001 0%。

2.3 豚鼠鼻部癥狀的改善 記錄豚鼠給藥前后15.0min內(nèi)抓鼻和噴嚏的次數(shù)。豚鼠在給予TDI刺激15.0min內(nèi)，均有明顯的抓鼻及打噴嚏現(xiàn)象，且鼻內(nèi)濕潤流涕。按照1.2.4項下的評分原則進行評分，各豚鼠總分?jǐn)?shù)均大于5分，表明造模成功。在分組給藥后，與模型組相比，各藥物組抓鼻次數(shù)和噴嚏次數(shù)均明顯降低。與辛芩全方相比，黃芩減方在改善豚鼠抓鼻次數(shù)方面具有顯著性的優(yōu)勢，但在改善豚鼠噴嚏次數(shù)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

2.4 血清中組胺的含量 按照試劑盒說明書，檢測豚鼠血清中組胺的含量，其結(jié)果如圖4所示。與空白組相比，模型組中組胺的含量顯著高于空白組，表明造模成功；各給藥組與模型組相比，組胺的含量顯著降低；但辛芩方和減方給藥后血清中組胺的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 馬兜鈴酸含量系統(tǒng)適應(yīng)性實驗圖譜

圖3 豚鼠給藥前后抓鼻（A）和噴嚏（B）次數(shù)（n＝7）

2.5 鼻黏膜形態(tài)學(xué)變化 各組鼻黏膜HE染色的結(jié)果顯示，在高倍鏡下隨機挑選豚鼠鼻黏膜切片5個視野，計算每組每個視野下嗜酸性粒細胞的平均數(shù)量。鼻黏膜形態(tài)觀察（圖5A～E）：空白組上皮細胞排列完整、緊密、無破壞；模型組鼻黏膜上皮層排列紊亂，邊緣不清；各給藥組與模型組比較，藥物組假復(fù)層纖毛柱狀上皮排列整齊緊密，鼻黏膜形態(tài)要優(yōu)于模型組。嗜酸性粒細胞：模型組空白組比較，鼻黏膜中可觀察到有大量的嗜酸性粒細胞浸潤（箭頭所指）；各給藥組與模型組相比，嗜酸性粒細胞數(shù)量均有顯著的下降；辛芩減方組與辛芩全方組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5F。

圖4 豚鼠血清中組胺的含量（n＝7）

圖5 豚鼠鼻黏膜HE染色

3 討論

黃芩作為辛芩方中的君藥，黃芩苷的含量高達9.000 0%以上，且黃芩苷具有抗過敏作用[9]，因此檢測該成分的含量對控制處方的質(zhì)量具有重要意義?！吨袊幍洹?010版第1部關(guān)于辛芩顆粒中黃芩苷的含量檢測采用等度洗脫的方法，但由于辛芩方成分復(fù)雜，導(dǎo)致該方法洗脫時間長。因此，本文采用梯度洗脫的方法建立黃芩苷的含量檢測方法，旨在保證含量檢測的同時，減少分析時間，降低檢測成本[12-13]。

細辛，具有祛風(fēng)散寒、止痛、通竅等功效，可用于治療鼻塞、鼻淵等。但細辛中含有微量的馬兜鈴酸，而馬兜鈴酸對腎臟的毒性已得到共識。在我國，自“龍膽瀉肝丸”事件后，中國出臺了《關(guān)于加強廣防己等6種藥材及其制劑監(jiān)督管理的通知》，對含有馬兜鈴、尋骨風(fēng)、天仙藤和朱砂蓮的中藥制劑必須憑醫(yī)生處方方可調(diào)配[14-15]?！吨袊幍洹?010版在細辛藥材檢測項下，規(guī)定細辛中馬兜鈴酸的含量應(yīng)不得大0.001 0%。而在香港，已停止審核、批準(zhǔn)，并不再銷售含馬兜鈴酸的中成藥，可見含馬兜鈴酸的中藥安全性應(yīng)引起足夠的重視。

因此，本文通過減掉辛芩方中潛在毒性藥材細辛，降低中藥辛芩方治療變應(yīng)性鼻炎的潛在不良反應(yīng)。動物藥效學(xué)實驗表明辛芩全方及減方在鼻部癥狀的改善、血清中組胺的含量、鼻黏膜形態(tài)及嗜酸性粒細胞數(shù)量方面均無明顯差異，在避免細辛中馬兜鈴酸帶來的潛在毒副作用的同時，可達到該藥對變應(yīng)性鼻炎的治療作用，為中藥更加安全合理地應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

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