沙利霉素增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶敏感性及其作用機(jī)制研究＊

劉 鵬，黃美松，胡陽(yáng)黔△

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北十堰442008；2.十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北十堰442011）

原發(fā)性肝癌（HCC）是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近幾年的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未清楚[1]。HCC的耐藥性是HCC晚期患者預(yù)后差和易復(fù)發(fā)的主要原因之一，因此，探索HCC耐藥性機(jī)制和尋找有效治療HCC的方法是研究人員最關(guān)心的問(wèn)題之一。目前，有近100多種抗癌藥物用于HCC的治療，而化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）是治療大多數(shù)早期癌癥如結(jié)直腸癌[2]、乳腺癌[3]、食管癌[4]以及原發(fā)性肝癌[5]有效的抗癌藥物。然而，由于中晚期癌癥患者對(duì)5-FU的耐藥性從而限制了其在臨床上的應(yīng)用，更為重要的是使用5-FU的患者容易對(duì)其他化療藥物產(chǎn)生耐藥性[6-7]。

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）的發(fā)現(xiàn)提示為什么5-FU能有效治療早期癌癥患者，而對(duì)晚期癌癥失效甚至對(duì)患者造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)[8-9]。研究認(rèn)為5-FU能夠靶向識(shí)別并抑制無(wú)限增殖和已分化的肝癌細(xì)胞，而對(duì)未分化的CSCs不起作用，提示CSCs是導(dǎo)致患者預(yù)后差和易復(fù)發(fā)最直接的原因[10]。最近，Gupta等[11]通過(guò)高通量篩選技術(shù)對(duì)16 000種抑制人乳腺癌CSCs的化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)只有沙利霉素（salinomycin，Sal）能選擇性抑制乳腺癌CSCs的增殖。研究發(fā)現(xiàn)Sal能抑制骨肉瘤CSCs和子宮內(nèi)膜CSCs的增殖[12-13]；近新研究證實(shí)Sal能抑制CD133＋陽(yáng)性（干細(xì)胞生物標(biāo)志物）肝癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的增殖[14-15]。這些研究結(jié)果提示5-FU與Sal聯(lián)合作用對(duì)處于不同階段的癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。因此，本文將5-FU與Sal聯(lián)合作用研究這種聯(lián)合作用是否能增加HCC對(duì)5-FU的敏感性從而殺死HCC干細(xì)胞，探討HCC發(fā)生與發(fā)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞生物研究所）；5-FU和MTT（Sigma公司）；沙利霉素（宜昌永諾藥業(yè)）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）、胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素（北京鼎國(guó)生物公司）；AnnexinV-FITC／PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（成都艾特姆生物科技公司）；兔抗人CD133、EPCAM、p-GSK-3β-Tyr216、βactin抗體（Santa公司）；p-β-catenin抗體、β-catenin（Cell Signaling Technology公司）；辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自中杉金橋公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2，SMMC-7721和MHCC-97H細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2及完全濕度的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 將增殖期的HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細(xì)胞以4.5×104個(gè)／孔接種于96孔板中，每孔100μL，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后棄掉培養(yǎng)基，各加入200 μL含不同終濃度5-FU（0、2、4、8、16μg／mL）和Sal（0、2、4、8、16μg／mL）的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（含DSMO的DMEM培養(yǎng)基），分別培養(yǎng)24、48、72h。后加入20μL 5mg／mL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加入150μL DMSO，振蕩使結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定492nm處的吸光值（OD值）。重復(fù)3次，按公式（1）計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.3 5-FU和Sal聯(lián)合作用 將增殖期的HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細(xì)胞以細(xì)胞密度為4.5×104個(gè)／孔接種于96孔板中，每孔100μL，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后棄掉培養(yǎng)基，分別混合交叉加入200μL含不同終濃度5-FU（0、2、4、8、16μg／mL）＋Sal（0、2、4、8、16μg／mL）的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（含DSMO的DMEM培養(yǎng)基），培養(yǎng)48h后運(yùn)用MTT法測(cè)定每孔OD值。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將增殖期的HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細(xì)胞離心收集后計(jì)數(shù)，以200個(gè)／皿接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h；向培養(yǎng)皿中加入5-FU和Sal使其終濃度分別為8μg／mL和4μg／mL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)12d，直到通過(guò)肉眼能清晰觀察到可見(jiàn)的細(xì)胞克??；將培養(yǎng)基倒掉，PBS洗滌，甲醇固定10min，PBS洗滌，吉姆薩染色10 min，自來(lái)水清洗，晾干后計(jì)數(shù)，按公式（2）計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。

1.2.5 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將增殖期的SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)消化后接種到6孔板中，培養(yǎng)24h后棄掉培養(yǎng)基，按下列實(shí)驗(yàn)因素作用細(xì)胞：PBS組，5-FU（8μg／mL），Sal（4μg／mL），5-FU（8 μg／mL）＋Sal（4μg／mL），作用48h后用PBS洗滌3次，消化離心收集細(xì)胞。按照Annexin-V／PI試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，先加入500μL的Binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5μL FITC標(biāo)記的Annexin-V和5μL PI混勻，室溫下避光孵育15min，運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)相同的方法分組處理后離心收集細(xì)胞，用藻紅蛋白偶聯(lián)的CD133抗體和FITC偶聯(lián)的EPCAM抗體4℃孵育30min，同時(shí)以加入藻紅蛋白偶聯(lián)的鼠IgG作為對(duì)照。死細(xì)胞通過(guò)標(biāo)記7-放線(xiàn)菌素D識(shí)別，運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD133（＋）-EPCAM（＋）陽(yáng)性SMMC-7721細(xì)胞。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 將增殖期的SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)消化后接種到6孔板中，培養(yǎng)24h后棄掉培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)1.2.5方法處理細(xì)胞，作用48h后收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，按照BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將總蛋白50μg進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，孵育一抗（p-GSK-3β-Tyr216，p-β-catenin，βcatenin和β-actin抗體），4℃過(guò)夜。洗膜、加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG（1∶2 000）室溫孵育1h。照片經(jīng)ECL后掃描，蛋白表達(dá)灰度值經(jīng)Quanity-One軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SEM）表示。組間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差分析后的成對(duì)比較采用S-N-K分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-FU和Sal抑制肝癌細(xì)胞的增殖 5-FU和Sal均能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞抑制率與濃度呈時(shí)間-劑量依賴(lài)效應(yīng)，見(jiàn)圖1。相同條件下，Sal對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用大于5-FU對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，當(dāng)5-FU和Sal濃度分別為8μg／mL和4μg／mL時(shí)細(xì)胞抑制率達(dá)到最大，5-FU和Sal對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用大于HepG2和MHCC-97H細(xì)胞。因此，在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和機(jī)制研究中以SMMC-7721細(xì)胞為研究對(duì)象。

圖1 MTT法測(cè)定5-FU和Sal對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

表15 -FU與Sal聯(lián)合作用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s）

表15 -FU與Sal聯(lián)合作用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s）

5-FU（μg／mL）Sal（μg／mL）0 2 4 8 16 0 0 0.248±0.035 0.312±0.006 0.348±0.023 0.471±0.021 2 0.319±0.025 0.446±0.078 0.523±0.018 0.541±0.091 0.583±0.033 4 0.412±0.081 0.519±0.062 0.562±0.091 0.633±0.048 0.715±0.042 8 0.513±0.059 0.573±0.088 0.611±0.102 0.682±0.055 0.748±0.072 16 0.588±0.042 0.650±0.079 0.739±0.083 0.783±0.031 0.899±0.038

表2 5-FU與Sal聯(lián)合作用對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響（±s）

表2 5-FU與Sal聯(lián)合作用對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響（±s）

5-FU（μg／mL）Sal（μg／mL）0 2 4 8 16 0 0 0.300±0.034 0.394±0.016 0.431±0.045 0.498±0.011 2 0.368±0.022 0.476±0.066 0.583±0.065 0.562±0.085 0.611±0.067 4 0.472±0.063 0.587±0.054 0.605±0.077 0.671±0.044 0.775±0.009 8 0.549±0.021 0.598±0.021 0.641±0.062 0.702±0.035 0.808±0.058 16 0.602±0.044 0.682±0.032 0.782±0.073 0.795±0.062 0.914±0.073

表3 5-FU與Sal聯(lián)合作用對(duì)MHCC-97H細(xì)胞增殖的影響（±s）

表3 5-FU與Sal聯(lián)合作用對(duì)MHCC-97H細(xì)胞增殖的影響（±s）

5-FU（μg／mL）Sal（μg／mL）0 2 4 8 16 0 0 0.285±0.088 0.361±0.022 0.415±0.055 0.444±0.063 2 0.341±0.015 0.442±0.047 0.548±0.079 0.541±0.089 0.591±0.059 4 0.428±0.033 0.538±0.081 0.585±0.041 0.649±0.081 0.682±0.029 8 0.505±0.063 0.567±0.034 0.602±0.064 0.684±0.077 0.778±0.066 16 0.582±0.058 0.665±0.051 0.713±0.057 0.735±0.041 0.854±0.091

2.2 5-FU和Sal聯(lián)合作用對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示5-FU和Sal聯(lián)合作用肝癌細(xì)胞48h后，細(xì)胞抑制率明顯高于5-FU或Sal單獨(dú)作用肝癌細(xì)胞時(shí)的抑制率，并且隨著5-FU或（和）Sal濃度的增加，這種協(xié)同作用越強(qiáng)。結(jié)果顯示，SMMC-7721細(xì)胞對(duì)5-FU和Sal協(xié)同作用的敏感性大于HepG2和MHCC-97H細(xì)胞，提示5-FU和Sal協(xié)同作用對(duì)不同的癌細(xì)胞存在差異性（表1～3）。結(jié)果證實(shí)，5-FU和Sal對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制具有協(xié)同作用，且對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)。

2.3 5-FU和Sal協(xié)同作用抑制肝癌細(xì)胞克隆形成 5-FU（8 μg／mL）、Sal（4μg／mL）和5-FU（8μg／mL）＋Sal（4μg／mL）分別作用HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細(xì)胞48h后，肝癌細(xì)胞增殖能力被顯著抑制（P＜0.01）。當(dāng)5-FU＋Sal共同作用肝癌細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同作用，肝癌細(xì)胞的克隆數(shù)顯著低于5-FU或Sal單獨(dú)作用細(xì)胞時(shí)的克隆數(shù)，見(jiàn)圖2。

2.4 5-FU和Sal聯(lián)合作用對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明，5-FU和Sal對(duì)HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細(xì)胞的增殖抑制具有協(xié)同作用，而且這一作用對(duì)SMMC-7721細(xì)胞最為明顯。而流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5-FU和Sal對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖3顯示，5-FU和Sal濃度為8μg／mL和4μg／mL時(shí)，SMMC-7721細(xì)胞凋亡率分別為（18.52±3.45）%和（20.64±2.15）%；當(dāng)二者聯(lián)合作用時(shí)，SMMC-7721細(xì)胞凋亡率達(dá)到（27.93±3.56）%，明顯高于二者單獨(dú)作用時(shí)的細(xì)胞凋亡率。

圖2 5-FU和Sal聯(lián)合作用對(duì)肝癌細(xì)胞單克隆形成的影響

2.5 5-FU和Sal聯(lián)合作用對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721腫瘤干細(xì)胞的影響 利用流式細(xì)胞儀測(cè)定SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)5-FU、Sal、5-FU和Sal作用48h后CD133（＋）-EPCAM（＋）陽(yáng)性SMMC-7721細(xì)胞水平，發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)5-FU作用48h后CD133（＋）-EPCAM（＋）細(xì)胞數(shù)量從（28.5±3.71）%增加到（47.9±4.33）%（P＜0.01）；而細(xì)胞經(jīng)Sal作用后CD133（＋）-EPCAM（＋）細(xì)胞數(shù)量顯著降低，從（28.5±3.71）%降低到（15.7±2.15）%（P＜0.01）。當(dāng)5-FU和Sal聯(lián)合作用細(xì)胞后CD133（＋）-EPCAM（＋）陽(yáng)性SMMC-7721細(xì)胞數(shù)與5-FU單獨(dú)作用時(shí)的細(xì)胞數(shù)比顯著降低，從（47.9± 4.33）%降低到（31.47±5.26）%，（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)5-FU和Sal對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響

圖4 5-FU和Sal對(duì)SMMC-7721腫瘤干細(xì)胞增殖的影響

2.6 Sal能抑制Wnt／β-catenin信號(hào)通路 研究證實(shí)Wnt／βcatenin信號(hào)通路參與致瘤性肝臟祖細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)，外在作用下激活肝臟祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝癌細(xì)胞[17-18]。Western-blot檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，與5-FU處理組比較，Sal和聯(lián)合作用組細(xì)胞中p-GSK-3β（Tyr216）蛋白表達(dá)量顯著增加；p-β-catenin蛋白表達(dá)量在Sal處理組細(xì)胞中明顯升高，當(dāng)二者聯(lián)合作用時(shí)降低。

圖5 Western-blot檢測(cè)5-FU和Sal對(duì)SMMC-7721細(xì)Wnt／β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)影響

3 討論

在HCC患者中，僅有30%～40%患者符合根治性治療，這些治療手段包括手術(shù)切除，肝移植以及肝動(dòng)脈栓塞化療，大多數(shù)患者希望通過(guò)化療來(lái)延長(zhǎng)生命。最新數(shù)據(jù)顯示HCC腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物（例如5-FU）表現(xiàn)出抗藥性。研究表明，EPCAM和CD133蛋白是肝癌細(xì)胞Huh7中腫瘤干細(xì)胞膜表面的生物標(biāo)志物[16]。以抑制腫瘤干細(xì)胞增殖為出發(fā)點(diǎn)用作臨床治療還面臨諸多挑戰(zhàn)，因?yàn)樵跉⑺腊┘?xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的時(shí)候可能需要多種藥物聯(lián)合作用。Sal是一種抗生素，能殺滅細(xì)菌，霉菌和寄生微生物，最新的研究表明，Sal能選擇性殺死乳腺癌腫瘤干細(xì)胞[12]和結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞[19]。研究發(fā)現(xiàn)Sal能抑制HCC細(xì)胞中CD133陽(yáng)性細(xì)胞的增殖[15]?？紤]到Sal這一獨(dú)特功能，本文以3種人肝癌細(xì)胞株為研究對(duì)象研究5-FU和Sal素聯(lián)合作用能否提高HCC細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。

本研究探討了Sal能否降低肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU的抗藥性。CD133和EPCAM蛋白是一種膜蛋白，在肝癌細(xì)胞中被視為腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞中存在CD133（＋）-EpCAM（＋）陽(yáng)性細(xì)胞[22]。本研究顯示5-FU和Sal聯(lián)合作用后CD133（＋）-EpCAM（＋）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低，而5-FU單獨(dú)作用后CD133（＋）-EpCAM（＋）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二者聯(lián)合作用顯著抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成。這一作用可能的原因是5-FU和Sal聯(lián)合作用抑制肝癌細(xì)胞中CD133（＋）-EpCAM（＋）陽(yáng)性細(xì)胞的增殖，提示通過(guò)Sal抑制肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞的增殖來(lái)提高HCC細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。研究證實(shí)Wnt／β-catenin信號(hào)通路的激活或抑制與癌細(xì)胞抗藥性密切相關(guān)[23]；Wnt／βcatenin信號(hào)通路在維持干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)方面起著重要作用[24]。β-catenin蛋白是Wnt／β-catenin信號(hào)通路中的重要組成部分，而Gsk-3β蛋白是β-catenin基因的上游調(diào)控因子，在外界條件的刺激下Gsk-3β蛋白與β-catenin蛋白結(jié)合進(jìn)而使其發(fā)生磷酸化而降解。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路由β-catenin蛋白介導(dǎo)，激活型β-catenin蛋白核轉(zhuǎn)移的積累可促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU的抗藥性。本研究發(fā)現(xiàn)Sal、5-FU＋Sal分別作用肝癌細(xì)胞后細(xì)胞通過(guò)上調(diào)β-GSK-3β（Tyr216）的表達(dá)抑制激活型β-catenin蛋白的表達(dá)，提示5-FU可抑制Wnt／β-catenin信號(hào)通路，而Sal和5-FU聯(lián)合作用可使這一功能得以恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)Sal通過(guò)抑制HCC細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的增殖來(lái)提高HCC細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。由此推測(cè)，除了5-FU之外，仍有大量的化療藥物可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞增殖的途徑使其對(duì)癌細(xì)胞治療失去作用。本研究為臨床對(duì)化療藥物失敏的HCC患者提供了新的治療方案。

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