血府逐瘀湯中桔梗牛膝對血瘀大鼠芍藥苷藥代動力學(xué)的影響

黃 巍，熊 偉，唐 燦，毛旭華，由鳳鳴

引經(jīng)理論始于金元時期， 在總結(jié)歸經(jīng)理論的基礎(chǔ)上提出，稱引經(jīng)藥能夠引導(dǎo)諸藥直達(dá)病所[1-2]。 血府逐瘀湯方出自王清任的《醫(yī)林改錯》，方中具有“引藥上行”的桔梗和“引血下行”的牛膝兩味引經(jīng)藥。 方中赤芍的主要有效成分芍藥苷具有抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管等藥理作用[3-4]，與血府逐瘀湯方活血化瘀的功效方向一致。 本研究就血府逐瘀湯中引經(jīng)藥的有無是否會影響方中有效成分芍藥苷的藥代動力學(xué)特性展開。 由于處于生理與病理狀態(tài)下大鼠體內(nèi)芍藥苷的藥動學(xué)特性可能不同，故本研究采用血瘀模型大鼠分別灌胃同劑量（以芍藥苷計）的血府逐瘀湯全方（簡稱全方）、血府逐瘀湯缺桔梗方（簡稱單缺桔梗方）、血府逐瘀湯缺牛膝方（簡稱單缺牛膝方）、血府逐瘀湯缺桔梗牛膝方（簡稱缺桔梗和牛膝方）藥液，研究桔梗、牛膝的配伍對芍藥苷藥代動力學(xué)的影響，初步探討桔梗、牛膝的“引經(jīng)作用”。

1 材料與方法

1.1 儀器 SPD-10Avp 型紫外-可見光檢測器（日本島津）；LC-10ATvp 型高效液相色譜儀（日本島津）；FA1004 型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

1.2 藥品和試劑 中藥飲片均購自四川本草堂藥業(yè)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張廷模教授鑒定合格。 芍藥苷對照品 （成都普菲德生物技術(shù)有限公司， 批號：121207，HPLC 含量≥98%）；核黃素對照品(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司， 批號：130114，HPLC 含量＞98%)；葡聚糖T500（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司，批號：F0115）；甲醇、乙腈為色譜純。

1.3 實驗動物 SD 大鼠24 只， 雌雄各半， 體重180～220 g，購自四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，動物合格證號：SCXK(川)2013-19。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流動相為乙腈- 水（16:84），流速1.0 ml/min，檢測波長230 nm，核黃素為內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)樣量20 μl。

1.4.2 藥液制備 按全方、單缺桔梗方、單缺牛膝方、缺桔梗和牛膝方的處方劑量，分別稱取45 倍處方量藥材，加水10 倍量，浸泡30 min，煎煮3 次，30 min/次，合并過濾煎液，濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮8 h，真空干燥箱干燥[5-6]，分別得全方、單缺桔梗方、 單缺牛膝方、 缺桔梗和牛膝方提取物粉末426、1054、948、650 g， 粉末 中 芍 藥 苷 含 量 分 別 為2290.35、2620.40、3365.82、3119.59 μg/g。 稱取提取物粉末各4.0 g，依次加入4.0、4.6、5.9、5.4 ml 水，攪拌使完全溶解，即得不同組方藥液。

1.4.3 溶液配制 芍藥苷工作液： 精密稱取芍藥苷對照品6.63 mg 于干燥棕色50 ml 容量瓶中，甲醇溶解定容， 搖勻即為對照品儲備溶液， 濃度為130.0 μg/ml。 取對照品儲備溶液適量， 用水稀釋成濃度為1.0 μg/ml，即得芍藥苷工作液。

內(nèi)標(biāo)工作液： 精密稱取核黃素對照品4.80 mg于干燥棕色50 ml 容量瓶中，70%甲醇溶解定容，搖勻即為內(nèi)標(biāo)儲備溶液，濃度為94.1 μg/ml。 取內(nèi)標(biāo)儲備溶液適量，用水稀釋60 倍即得內(nèi)標(biāo)工作液，濃度為1.57 μg/ml。

5%葡聚糖T500 溶液： 精密稱取葡聚糖T500 0.2 g 加入0.9%氯化鈉注射液4.0 ml，水浴加熱并攪拌，使其完全溶解，溶液呈無色透明，0 ℃冷藏備用。

1.4.4 動物分組、造模與給藥 24 只大鼠禁食12 h，自由飲水。采用5%葡聚糖T500 溶液，按2 ml/kg尾靜脈推注[7]，建立血瘀模型。 30 min 后，將模型大鼠隨機(jī)分為全方組、單缺桔梗方組、單缺牛膝方組、缺桔梗和牛膝方組，每組6 只，雌雄各半。按5 ml/kg體重，相應(yīng)灌胃全方、單缺桔梗方、單缺牛膝方、缺桔梗和牛膝方藥液，以芍藥苷計灌胃劑量為11.452 mg/kg。

1.4.5 檢測 分別于灌胃后10 min、15 min、30 min、45 min、1.5 h、2.5 h、4 h，自大鼠眼眶靜脈叢取血，靜置10～20 min，5000 r/min 離心10 min，取血清100 μl，加入乙腈250 μl、 內(nèi)標(biāo)工作液20 μl，2000 r/min 旋渦沉淀蛋白，5000 r/min 離心10 min， 轉(zhuǎn)移上清液，40 ℃水浴通氮吹干，100 μl 水復(fù)溶，20 μl 進(jìn)樣，高效液相色譜儀檢測芍藥苷的含量[8]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS13.0 軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以±s 表示，藥動學(xué)參數(shù)AUC(0-t)、Cmax取自然對數(shù)后進(jìn)行單因素方差分析，Ka、Ke、Tmax、t1/2進(jìn)行非參t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠灌胃后，按“1.4.5 檢測”項下檢測，記錄色譜圖， 芍藥苷與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算出血清中芍藥苷濃度(圖1)。藥時曲線數(shù)據(jù)經(jīng)DAS2.0 軟件擬合藥代動力學(xué)參數(shù)(表1)?；谌苯酃：团Ｏシ?， 芍藥苷藥動學(xué)參數(shù)直接比較后結(jié)果為：單缺牛膝方能增大芍藥苷Ke，減小AUC(0-t)、Ka、Cmax、Tmax、t1/2；單缺桔梗方能增大芍藥苷AUC(0-t)、Tmax、t1/2，減小Ka、Ke、Cmax；全方能增大Ke、Cmax，減小AUC(0-t)、Ka、Tmax、t1/2。

3 討論

引經(jīng)藥桔梗被稱為能“載藥上行”，引經(jīng)藥牛膝被稱為能“引血下行”。 桔梗、牛膝作為引經(jīng)藥使用，能否影響芍藥苷的藥代動力學(xué)特性？ 兩味引經(jīng)藥的作用一升一降，配伍使用后“引經(jīng)作用”減弱或加強？基于缺桔梗和牛膝方，藥動學(xué)參數(shù)直接比較發(fā)現(xiàn)：單缺牛膝方和單缺桔梗方對芍藥苷的Ke、AUC(0-t)、Tmax、t1/2的影響趨勢相反， 對參數(shù)Ka、Cmax的影響趨勢同為減?。唤酃?、牛膝配伍使用(全方)對參數(shù)Ka、Cmax的影響趨勢變?yōu)樵龃?，對參?shù)AUC(0-t)、Tmax、t1/2的影響趨勢同單缺牛膝方。 然而，藥動學(xué)參數(shù)統(tǒng)計比較發(fā)現(xiàn)：參數(shù)AUC(0-t)、Ka、Cmax組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；全方組Ke 明顯大于單缺桔梗方組、 缺桔梗和牛膝方組(P ＜0.05)；全方組t1/2明顯小于單缺桔梗方組、缺桔梗和牛膝方組(P ＜0.05)；單缺桔梗方組Tmax明顯大于全方組、單缺牛膝方組(P ＜0.05)。 因此，本實驗結(jié)果說明：桔梗、牛膝作為引經(jīng)藥的使用，確能影響芍藥苷部分藥代動力學(xué)參數(shù)；桔梗、牛膝配伍明顯影響芍藥苷的Ke，使“引經(jīng)作用”加強。

圖1 血瘀大鼠灌胃不同組方藥液后藥時曲線(n=6)

有學(xué)者認(rèn)為，應(yīng)立足于中藥在體內(nèi)發(fā)揮作用的各關(guān)鍵環(huán)節(jié)，展開“引經(jīng)作用”的探討[9]。 根據(jù)本實驗結(jié)果，擬從芍藥苷在體內(nèi)“吸收- 分布- 消除”過程，對桔梗、牛膝引經(jīng)作用機(jī)理進(jìn)行假設(shè)：桔梗和牛膝中某些成分與芍藥苷在體內(nèi)存在既競爭又促進(jìn)的關(guān)系。 吸收過程(Ka、Cmax、Tmax)：單缺牛膝方和單缺桔梗方主要表現(xiàn)為競爭吸收； 桔梗牛膝配伍使用(全方)，主要表現(xiàn)為促進(jìn)吸收。所以，血瘀大鼠灌胃全方后，Ka、Cmax都高于任何一個缺引經(jīng)藥方， 而Tmax都不高于任何一個缺引經(jīng)藥方。 血瘀大鼠灌胃單缺桔梗方或單缺牛膝方，Ka、Cmax都低于缺桔梗和牛膝方。 分布過程(V)：給藥途徑為灌胃，F(xiàn) 未知，表觀分布容積(V)和清除率(CL)都未知，但V/F 灌胃全方后最小，表明引經(jīng)藥能影響芍藥苷的體內(nèi)分布。 消除過程(Ke)：桔梗和牛膝中的某些成分和芍藥苷可能表現(xiàn)為競爭關(guān)系， 如這些成分更易與血中蛋白結(jié)合，使血中游離芍藥苷增多，芍藥苷就更易被消除，故血瘀大鼠灌胃全方、 單缺牛膝方后，Ke 高于缺桔梗和牛膝方；這些成分與芍藥苷也可能表現(xiàn)為促進(jìn)關(guān)系，如促進(jìn)游離芍藥苷向組織臟器轉(zhuǎn)移，使芍藥苷消除變慢， 故血瘀大鼠灌胃單缺桔梗方后，Ke 低于缺桔梗和牛膝方。

本研究證實了桔梗、牛膝的引經(jīng)作用，并從“吸收-分布-消除” 過程展開了引經(jīng)作用機(jī)理的設(shè)想。雖不能揭示具體的引經(jīng)作用機(jī)理，但表明需從吸收部位、血中蛋白結(jié)合、組織分布、代謝部位、排泄途徑等角度來進(jìn)一步研究引經(jīng)作用機(jī)理。

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