不同缺氧條件對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成分組成和細(xì)胞分化的影響

任紅英，趙欽軍，王彤，程雪蓮，程濤(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300020)

不同缺氧條件對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成分組成和細(xì)胞分化的影響

任紅英，趙欽軍，王彤，程雪蓮，程濤(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300020)

摘要：目的觀察不同缺氧條件對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)成分組成的影響。方法Balb/c小鼠15只脫頸處死，取雙側(cè)股骨，分離BMSC接種于T25培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、缺氧1組、缺氧2組、氯化鈷組。各組細(xì)胞分別以低密度(5×102/cm2)、中密度 (1×104/cm2)、高密度 (1.5×106/cm2)接種于培養(yǎng)基。對(duì)照組置于常氧條件(37 ℃、5% CO2、21%O2)培養(yǎng)，缺氧1組于2.5%～4%O2、5%CO2、91%～92.8%N2條件下培養(yǎng)，缺氧2組置于7%～8%O2、5%CO2、87%～88%N2條件下培養(yǎng)。氯化鈷組在培養(yǎng)基中加入氯化鈷 100 μΜ/L。各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后觀察結(jié)果。光鏡及透射電鏡下觀察BMSC細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞中堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)OCT4及內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因(VEGF、FLT-1、FLK-1)表達(dá)。結(jié)果對(duì)照組以梭形成纖維樣細(xì)胞為主，少有細(xì)胞融合現(xiàn)象；缺氧1、2組出現(xiàn)較多個(gè)體較大、扁平而寬闊的骰子樣細(xì)胞；氯化鈷組細(xì)胞呈圓形，個(gè)體較小。缺氧1組BMSC增殖率高于缺氧2組；中密度接種細(xì)胞增殖率最高；氯化鈷組細(xì)胞增殖受到明顯抑制。缺氧1、2組ALP染色陽(yáng)性細(xì)胞多于對(duì)照組及氯化鈷組，且缺氧1組高于缺氧2組(P均<0.05)。缺氧1、2組OCT4基因表達(dá)受到抑制，僅對(duì)照組及氯化鈷組OCT4基因表達(dá)陽(yáng)性。VEGF在缺氧1、2組表達(dá)均為陰性，而在氯化鈷組表達(dá)陽(yáng)性；各組FLK-1基因表達(dá)均為陽(yáng)性；FLT-1基因表達(dá)均為陰性。結(jié)論在2.5%～4%O2、1×104/cm2接種密度條件下，小鼠BMSC中一種分化程度較高、寬闊、扁平、ALP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞比例進(jìn)一步增高。

關(guān)鍵詞：缺氧；骨髓基質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞分化

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)是一群成分復(fù)雜的混合細(xì)胞，由兩群形態(tài)差別較大的細(xì)胞組成，一群為紡錘樣的長(zhǎng)梭形細(xì)胞(RS)；另一群細(xì)胞個(gè)體較大，形態(tài)扁平、寬闊呈骰子形，這群細(xì)胞被認(rèn)為分化程度較高。正常氧(21% O2)條件下培養(yǎng)時(shí)，前者占絕大多數(shù)，后者比例很小[1]，但后者細(xì)胞個(gè)體較大、胞質(zhì)伸展，是許多造血細(xì)胞黏附、增殖和形成克隆的重要場(chǎng)所。因此，將該類細(xì)胞從骨髓中分離出來(lái)，研究其生物學(xué)特點(diǎn)和功能，將為骨髓造血調(diào)控研究提供重要依據(jù)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，缺氧培養(yǎng)可使小鼠BMSC中這類形態(tài)扁平、寬闊、個(gè)體較大的細(xì)胞比例增高，同時(shí)該類細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)染色陽(yáng)性[2]。2010年8月～2014年10月，我們觀察了不同缺氧條件對(duì)BMSC成分組成的影響，以期獲得更高比例的目標(biāo)細(xì)胞，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料Balb/c小鼠15只，8～12周齡，雌雄各半(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供)。IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(trypsin)為Hyclone公司產(chǎn)品。ALP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所科技公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠BMSC的分離 Balb/c小鼠脫頸處死，消毒后取雙側(cè)股骨，自中間剪斷后用IMDM沖出骨髓細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度，接種于T25培養(yǎng)瓶中。分別置于37 ℃、5% CO2、21%O2常氧條件和不同濃度缺氧條件下培養(yǎng)，24 h后傾倒懸浮細(xì)胞上清液。以后每2～3 d半量換液。待原代培養(yǎng)的細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底的70%～80%開(kāi)始傳代培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)行CD44、CD29、CD34、CD31、CD45表型檢測(cè)以鑒定BMSC[2]。

1.2.2細(xì)胞分組與處理將BMSC隨機(jī)分為對(duì)照組、缺氧1組、缺氧2組、氯化鈷組。各組細(xì)胞分別以低密度(5×102/cm2)、中密度(1×104/cm2)、高密度(1.5×106/cm2)接種于培養(yǎng)基(IMDM+10%FBS)。對(duì)照組置于常氧條件(37 ℃、5% CO2、21%O2)培養(yǎng)。缺氧1組將原代培養(yǎng)的BMSC置于密閉缺氧罐中注入2.5%～4%O2、5%CO2、91%～92.8%N2的混合氣體5 L/min×5 min，夾閉5 min后再次通氣，如此反復(fù)3次后夾閉，將密閉缺氧罐置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)到指定時(shí)間。缺氧2組置于7%～8%O2、5%CO2、87%～88%N2條件下培養(yǎng)，操作過(guò)程參考缺氧1組。氯化鈷組在培養(yǎng)基中加入氯化鈷 100 μΜ/L。各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后觀察結(jié)果。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察普通光學(xué)顯微鏡下觀察BMSC細(xì)胞形態(tài)。收集原代培養(yǎng)7 d的細(xì)胞懸液以2 000 r/min離心10 min，使細(xì)胞成團(tuán)，經(jīng)2．5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇系列脫水，Epon812包埋及LKB-11超薄切片機(jī)切片，在JEOL-1200EX透射電鏡下觀察并拍照，觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4細(xì)胞增殖測(cè)定每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)7 d，將各組BMSC消化后采用胎盤(pán)藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較，計(jì)算細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞計(jì)數(shù)-對(duì)照組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5細(xì)胞ALP檢測(cè)將BMSC原代培養(yǎng)8～9 d的蓋玻片取出，0.1 mmol/L PBS洗滌2次。用吹風(fēng)機(jī)快速吹干，并以4%多聚甲醛固定10 min后，采用免疫組化法檢測(cè)ALP，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。ALP陽(yáng)性染色主要位于BMSC中一種個(gè)體較大的扁平細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞質(zhì)呈淡紫色染色為陽(yáng)性結(jié)果，呈黃色為陰性結(jié)果。

1.2.6OCT4基因及內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因檢測(cè)MSC培養(yǎng)7 d后，采用RT-PCR法檢測(cè)。提取各組細(xì)胞總RNA，OCT4基因上游引物序列為5′-TGGCATACTGTGGACCTCAGGTT-3′，下游引物序列為5′-TTTCCAAAGAGAACGCCCAGGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為319 bp；FLT-1上游引物序列為 5′-TGTGGAGAAACTTGGTGACCT-3′，下游引物序列為 5′-TGGAGAACAGCAGGACTCCTT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度504 bp;FLK-1 上游引物序列為5′-AGAACACCAAAAGAGAGGAACG-3′，下游引物序列為 5′-GCACACAGGCAGAAACCAGTAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度383 bp; VEGF上游引物序列為5′-GCAGGCTGCTGTAACGATGAAG-3′，下游引物序列為5′-CAAGGCTCACAGTGATTTTCTGGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度185 bp。PCR條件為：93 ℃預(yù)變性3 min，隨后93 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再于72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。率的比較用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)光鏡下對(duì)照組以梭形成纖維樣細(xì)胞為主，少有細(xì)胞融合現(xiàn)象；缺氧1組、缺氧2組出現(xiàn)較多個(gè)體較大、扁平而寬闊的骰子樣細(xì)胞；氯化鈷組細(xì)胞呈圓形，個(gè)體較小。電鏡下(4 000×)，對(duì)照組細(xì)胞核以梭形為主，細(xì)胞以較長(zhǎng)的梭形形態(tài)居多，BMSC超微結(jié)構(gòu)清晰，線粒體嵴排列規(guī)則，異染色質(zhì)均勻；缺氧1、2組細(xì)胞形態(tài)扁平、寬闊者比例較高，以寬闊、圓形細(xì)胞核為主，且核仁較大，多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為分化程度增高，細(xì)胞器相對(duì)完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多；氯化鈷組細(xì)胞形態(tài)較小，細(xì)胞核圓形，細(xì)胞內(nèi)空泡很少。

2.2細(xì)胞增殖率在BMSC不同接種密度條件下，細(xì)胞增殖率有明顯差別，以中密度(1×104/cm2)接種者細(xì)胞增殖最為明顯，缺氧1組細(xì)胞增殖率高于缺氧2組；而氯化鈷組增殖受到明顯抑制。詳見(jiàn)表1。

組別細(xì)胞增殖率低密度接種中密度接種高密度接種缺氧1組19.6±14.240.1±4.7#*7.8±4.5#缺氧2組10.2±4.127.2±4.7*4.8±3.7氯化鈷組0-65.3±5.3-73.3±8.9

注：與缺氧2組同一密度相比，#P<0.05；與同組低、高密度接種者相比，*P<0.05。

2.3ALP及OCT4基因表達(dá)缺氧1組、缺氧2組ALP陽(yáng)性細(xì)胞率高于對(duì)照組及氯化鈷組，且缺氧1組高于缺氧2組，氯化鈷組低于對(duì)照組(P均<0.05，見(jiàn)表2)。缺氧1、2組OCT4基因表達(dá)受到抑制，僅對(duì)照組及氯化鈷組OCT4基因表達(dá)陽(yáng)性。

組別ALP染色陽(yáng)性細(xì)胞率低密度接種中密度接種高密度接種缺氧1組5.8±1.621.60±2.3*#10.40±2.3*缺氧2組3.8±1.411.50±1.9*6.80±2.5氯化鈷組- 0.48±0.0*0.29±0.1對(duì)照組1.9±0.34.50±0.42.80±0.5

注：與對(duì)照組同一密度組相比，*P<0.05；與缺氧1組、缺氧2組同一接種密度組相比，#P<0.05。氯化鈷低密度接種組由于大部分細(xì)胞突起脫落，活細(xì)胞數(shù)目少，故未計(jì)算數(shù)據(jù)。

2.4內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)VEGF在缺氧1、2組表達(dá)均為陰性，而在氯化鈷組表達(dá)陽(yáng)性；各組FLK-1基因表達(dá)均為陽(yáng)性，F(xiàn)LT-1基因表達(dá)均為陰性。各組內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)差異不大。

3討論

ALP染色在血細(xì)胞特征研究中有重要作用[10]，正常的BMSC中ALP表達(dá)較少,而缺氧促進(jìn)該類細(xì)胞中ALP高表達(dá)，ALP高表達(dá)與細(xì)胞分化程度增高相一致。ALP檢測(cè)可能成為純化目標(biāo)細(xì)胞的一種方法。本研究中，缺氧1組較缺氧2組、對(duì)照組BMSC中ALP陽(yáng)性率升高，說(shuō)明該缺氧條件可使ALP陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞增多。OCT4基因是未分化細(xì)胞的重要標(biāo)志，在胚胎干細(xì)胞和BMSC中均有表達(dá)[11,12]，由于早期的MSC還包括第三群細(xì)胞即非常小的圓形細(xì)胞，具有快速自我更新能力[1]，其可能與BMSC OCT4基因表達(dá)陽(yáng)性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧1、2組OCT4基因表達(dá)丟失，而缺氧模擬物氯化鈷不能抑制OCT4基因表達(dá)，說(shuō)明缺氧促進(jìn)了BMSC的分化，而氯化鈷沒(méi)有該作用。

缺氧能上調(diào)許多基因表達(dá)，特別是與血管新生和造血有關(guān)的基因表達(dá)[13,14]。缺氧可促進(jìn)血管新生，使內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而骨髓基質(zhì)中有內(nèi)皮細(xì)胞存在，有報(bào)道1% O2處理可誘導(dǎo)BMSC中VEGF表達(dá)和血管形成[15,16]。本研究結(jié)果顯示，各組BMSC均表達(dá)FLK-1基因，該基因產(chǎn)物VEGF2受體在介導(dǎo)VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖及造血細(xì)胞發(fā)育方面起重要作用。FLK-1基因在BMSC中表達(dá)，說(shuō)明在合適的外界刺激下，BMSC有分化成內(nèi)皮細(xì)胞從而形成血管的潛能。我們進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，3% O2處理的BMSC并不表達(dá)VEGF基因，從而無(wú)法誘導(dǎo)血管形成。但缺氧模擬物氯化鈷處理卻能使VEGF基因表達(dá)上調(diào)，所以氯化鈷具有一定的模擬缺氧的作用。FLT-1基因與內(nèi)皮細(xì)胞重排和血管平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)，各組FLT-1基因表達(dá)均為陰性表明骨髓中多以血竇為主，而真正有功能的血管形成需要多種因素參與，特別是細(xì)胞外基質(zhì)成分共同作用。因此，不同缺氧濃度的選擇對(duì)BMSC分化和細(xì)胞成分組成的影響不同，氯化鈷亦不能完全模擬缺氧的作用。

總之，本研究設(shè)定了不同的缺氧培養(yǎng)條件，從BMSC中獲得更高比例寬闊、扁平及ALP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，并證明該類細(xì)胞能夠在較低的缺氧條件下增殖。綜合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為3%～4%O2、1×104/cm2細(xì)胞接種密度對(duì)于BMSC分化篩選效果更好。然而，對(duì)于目標(biāo)細(xì)胞缺氧耐受性產(chǎn)生的機(jī)制仍不清楚，今后有望通過(guò)深入研究缺氧條件下BMSC中表面分子和信號(hào)通路的變化來(lái)闡明其耐受原因，進(jìn)一步了解缺氧對(duì)BMSC的影響，尋找更合理的純化目標(biāo)細(xì)胞的方法。

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Effect of different hypoxic conditions on the cell constituents of murine bone marrow stromal cells

RENHong-ying,ZHAOQin-jun,WANGTong,CHENGXue-lian,CHENGTao

(StateKeyLaboratoryofExperimentalHematology,InstituteofHematologyChinese

AcademyofMedicalSciences,Tianjin300020,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of different hypoxic conditions on the cellular constituents of mice bone marrow stromal cells (BMSC). MethodsFifteen Balb/c mice were taken off the neck to death, and bone marrow were collected from the femoral diaphysis. The isolated BMSC were plated in T25 culture flasks. The isolated bone marrow cells were randomly divided into control group, hypoxia 1 group, hypoxia 2 group, and COCl2group. BMSC in each group were seeded at low density(1×102/cm2), medium density(1×104/cm2), and high density(1×106/cm2) in culture medium. The control group cell was cultured at normoxic conditions(37 ℃，5% CO2，21%O2). The hypoxia 1 group cell was cultured at 2.5%～4%O2, 5%CO2and 91%～92.8%N2. The hypoxia 2 group cell was cultured at 7%～8%O2, 5%CO2, 88%～87%N2, as well as 100 μmol/L COCl2was added in COCl2group. The culture results were observed 7 days after seeding. The morphology and ultrastructure of BMSC were observed by light microscope and transmission electron microscope, and the expression of ALP was analyzed by immunohistochemistry. The OCT4 gene and endothelial cells relative genes (VEGF, FLT1, FLK1) were detected by RT-PCR. ResultsThe number of cells in hypoxic 1 group significantly increased compared to the control group and hypoxia 2 group, while COCl2inhibited the proliferation of BMSC. The morphology of BMSC in hypoxic group was wide, flat and big. The ultrastructure analysis showed that there were more vacuoles after under hypoxic conditions than the number under normoxic conditions. The proportion of ALP positive cells in BMSC under hypoxic culture increased compared to that under control group and hypoxia 2 group. However, the morphology of BMSC was small and round after COCl2treatment, and no ALP positive cells existed in COCl2group. Furthermore，hypoxia inhibited the expression of OCT4 gene, and can not increase the expression of endothelial cells relative genes such as VEGF, FLT1 and FLK1. Conclusion When plated at 1×104/cm2density under 2.5% to 4%O2concentration, a kind of BMSC cell type, which was wide, flat, ALP positive and high differentiated cell increased in the proportion of BMSC.

Key words:hypoxia; bone marrow stromal cells; differentiation

(收稿日期：2014-11-03)

作者簡(jiǎn)介：第一任紅英(1976-)，女，碩士，副研究員，研究方向?yàn)槿毖鹾驮煅h(huán)境。E-mail: hongying.ren@yahoo.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(81000196)。

中圖分類號(hào)：Q813

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)02-0020-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.007