ret和ednrb在先天性巨結(jié)腸癥及巨結(jié)腸類源病腸壁表達(dá)的研究

張怡先張利兵閆煥鐘麟(.成都市婦女兒童中心醫(yī)院外一科,四川成都 60000; 2.四川大學(xué)華西附屬第一醫(yī)院小兒外科,四川成都 6004)

ret和ednrb在先天性巨結(jié)腸癥及巨結(jié)腸類源病腸壁表達(dá)的研究

張怡先1張利兵1閆煥1鐘麟2△
(1.成都市婦女兒童中心醫(yī)院外一科,四川成都 610000; 2.四川大學(xué)華西附屬第一醫(yī)院小兒外科,四川成都 610041)

摘要目的:通過探討ret、ednrb基因在先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung disease,HD)及巨結(jié)腸類緣病(Hirschsprung allied disease,HAD)患者腸壁的表達(dá)分布情況,旨在進一步了解HD與HAD發(fā)病機制的異同,為HD與HAD的診斷及治療提供新的研究方向。同時通過常規(guī)HE染色與免疫組化標(biāo)記時HD與HAD診斷的比較,深入了解免疫組化標(biāo)記技術(shù)在HD和HAD診斷中的臨床價值。方法:復(fù)習(xí)巨結(jié)腸術(shù)后病例HE切片,結(jié)合光鏡下腸壁的形態(tài)特征,初步診斷分組。應(yīng)用蛋白基因產(chǎn)物9.5(Protein gene product 9.5,PGP9.5)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)免疫組化技術(shù)對經(jīng)HE染色病理初步診斷為HD, HAD和不明確組的病變腸段再次診斷分組。HD腸段分別取狹窄段和擴張段與10例正常結(jié)腸行RET抗體、EDNRB抗體免疫組化染色,比較RET和EDNRB的染色結(jié)果和分布特點。結(jié)果:HE染色8例診斷不明確者,經(jīng)免疫組化標(biāo)記后診斷明確;RET在HD狹窄段中表達(dá)較HAD和正常對照組減少(P<0.05);EDNRB在HD狹窄段中表達(dá)較HAD和正常對照組減少(P<0.05);HD 和HAD擴張段與正常組的RET與EDNRB表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:免疫組化染色有助于HD和HAD的診斷; RET和EDNRB在HD狹窄段中表達(dá)有異常,提示RET和EDNRB與HD的發(fā)生可能有關(guān)。

關(guān)鍵詞:先天性巨結(jié)腸癥;巨結(jié)腸同源病;蛋白基因產(chǎn)物9.5;神經(jīng)元特異性烯醇化酶;受體型酪氨酸激酶基因;內(nèi)皮素B受體基因;免疫組化

1886年丹麥醫(yī)生Harald Hirschsprung首先報告2例有便秘癥狀患兒,尸檢見有巨結(jié)腸,故將該病稱為先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung disease,HD)。1920年Valla指出該病的基本病理改變?yōu)閿U大結(jié)腸遠(yuǎn)端痙攣腸管的肌間及粘膜下神經(jīng)叢內(nèi)缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。后來人們發(fā)現(xiàn)有的病例具有典型HD臨床表現(xiàn)但腸壁神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存在,因而逐漸認(rèn)識到可能存在其他各種不同的腸神經(jīng)系統(tǒng)異常,于是提出巨結(jié)腸類緣病(Hirschsprung allied disease,HAD)的概念。HAD包括腸神經(jīng)元性發(fā)育異常(Intestinal neuronal dysplasia,IND),神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥(Hypoganglionosis,HP),腸神經(jīng)發(fā)育不良。HD和HAD統(tǒng)稱為腸神經(jīng)元異常(Intestinal dysganglionoses,IDs)。

HD為小兒常見疾病,其發(fā)病率約為1:5000,男女比例為3 -4:1。對HD的病因?qū)W研究已有近百年的歷史,但至今尚未完全清楚。對于該病病因和發(fā)病機制的研究仍然是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的課題。受體型酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinases gene,ret)基因定位于染色體10q11.2區(qū)域[1],Ret基因編碼的RET蛋白為114個殘基跨膜蛋白,有一個富含半光氨酸激酶的細(xì)胞區(qū)。激活RET受體需要和它的配體結(jié)合形成復(fù)合體,膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(GDNF family receptor alpha-1,GFRα1)結(jié)合形成的RET配體。ret基因和gefα1基因在腸神經(jīng)系統(tǒng)要進入消化道時表達(dá),而GDNF則當(dāng)腸神經(jīng)系統(tǒng)遷移至食管時在胃中表達(dá)[2]。ret、gdnf或gfrα1突變的小鼠,腸神經(jīng)系統(tǒng)將不能定植于從食管開始的大部分消化道,這種腸神經(jīng)元的缺失可能是由于神經(jīng)細(xì)胞凋亡或移植的失敗[2]。Schuchardt[3]等敲除斑馬魚和小鼠ret基因后,其腸道出現(xiàn)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失。Shepherd[4]通過對ret基因突變的小鼠研究發(fā)現(xiàn),ret純合子突變的小鼠出生后很快死亡,解剖發(fā)現(xiàn)其全消化道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失。實驗證實gdnf基因雜合突變的小鼠大約有50%出現(xiàn)腸神經(jīng)元的減少[5],推測是由于腸神經(jīng)元增殖減少和腸神經(jīng)元遷移推遲引起[6]。體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)GDNF是一個啟動腸神經(jīng)系統(tǒng)的化學(xué)信號,推測GDNG可能啟動RET和GFRα1表達(dá),促使腸神經(jīng)系統(tǒng)遷移到消化道中。綜上所述,推測GDNF-RET-GFRα1信號通路對腸神經(jīng)系統(tǒng)的存活、增殖和遷移有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)另一個對腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有重要影響的途徑是血管內(nèi)皮素途徑(EDN3-EDNRB途徑)。血管內(nèi)皮素3(Endothelin gene3,edn 3)基因?qū)儆诓溉閯游镏幸阎軆?nèi)皮素(Endothelin gene,edn)基因家族中的成員。edn3基因編碼238個氨基酸的前體物質(zhì),定位于人染色體20q13.2-13.3。EDN3對后腸神經(jīng)細(xì)胞定植有重要作用,它的作用機制現(xiàn)在仍存在爭論。其中一種主要的觀點是EDN3通過抑制腸神經(jīng)前體細(xì)胞的分化,促進腸神經(jīng)前體細(xì)胞增殖來保持腸神經(jīng)前體細(xì)胞庫的數(shù)量。EDN3失活將使細(xì)胞增殖減少和前體細(xì)胞過早的分化,最后導(dǎo)致沒有足夠的祖細(xì)胞到后腸[7]。EDN3促進腸神經(jīng)系統(tǒng)的增殖得到很多科研小組支持[8]。Nandor[9]敲除雞的edn3基因也得到了后腸腸神經(jīng)元缺失的模型。ednrb基因位于13q22,約24 kb,含7個外顯子和6個內(nèi)含子,其編碼產(chǎn)物為具有442個氨基酸的蛋白質(zhì),該基因被認(rèn)為是僅次于ret基因的HD重要易感基因[10],內(nèi)皮素B受體基因(Endothelin B receptor gene,ednrb)屬于G蛋白偶聯(lián)受體,與配體結(jié)合被激活后,誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流入細(xì)胞,在胚胎發(fā)育期間,調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞與腸間充質(zhì)細(xì)胞的相互作用,使神經(jīng)嵴細(xì)胞可以正常發(fā)育、分化和遷移。而且表達(dá)EDNRB的內(nèi)皮細(xì)胞參與內(nèi)皮素激活一氧化氮合酶的過程,EDNRB在腦、腎、肺和心臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞存在表現(xiàn)。最近發(fā)現(xiàn)其也存在結(jié)腸內(nèi),尤其是在肌間神經(jīng)叢、粘膜下層及粘膜下的血管組織內(nèi)。EDN3與EDNRB結(jié)合,組成EDN3-EDNRB內(nèi)皮素信號傳導(dǎo)通路[11]。同樣為腸神經(jīng)元異常的HAD的基因?qū)W研究目前還不是很多。本研究通過探討ret、ednrb基因在HD及HAD患者腸壁的表達(dá)分布情況,旨在進一步了解HD與HAD發(fā)病機制的異同,為HD與HAD的診斷和防治提供新的研究方向。同時通過常規(guī)HE染色與免疫組化標(biāo)記時HA及HAD診斷的比較深入了解免疫組化標(biāo)記技術(shù)在HD和HAD疾病診斷中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 病史資料的收集

調(diào)閱四川大學(xué)華西醫(yī)院1997年1月~2010年1月原始病例,記錄姓名,性別,年齡,臨床表現(xiàn)及各種術(shù)前檢查資料,手術(shù)記錄,病理報告等。

1.1.1 一般資料

1997年1月~2007年1月術(shù)前診斷為HD而行巨結(jié)腸根治術(shù)病例230例,隨機選取40例,復(fù)習(xí)HE切片,并進行初步分組,其中HD組16例,HAD組16例,不確定組8例。均取狹窄段、擴張段術(shù)后石蠟標(biāo)本連續(xù)切片行NSE、PGP9.5、RET和EDNRB免疫組織化學(xué)染色。

1.1.2 材料

來源于四川大學(xué)華西醫(yī)院1997年1月-2007年1月行巨結(jié)腸根治手術(shù)的術(shù)后石蠟標(biāo)本40例為實驗組,10例尸檢(解剖未發(fā)現(xiàn)消化道畸形或病變)的結(jié)腸標(biāo)本為對照組。

首先對術(shù)前診斷為巨結(jié)腸的術(shù)后HE染色切片重新讀片。初步選取診斷HD明確組16例,HAD組16例,另再選取鏡下形態(tài)學(xué)特征不典型不能確診為HD或HAD的有8例,歸為不確定組。同時,選取尸檢(解剖未發(fā)現(xiàn)消化道畸形或病變)10例的結(jié)腸標(biāo)本行免疫組織化學(xué)染色作為對照組。

1.2.1 免疫組化染色SP法

蒸餾水沖洗,PBS浸泡5 min。3% H2O2室溫孵育5~10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS沖洗,2 min ×3次。5~10%正常山羊血清封閉,室溫孵育10 min。傾去血清,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,4℃過夜。PBS沖洗,2 min×3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSAPBS稀釋),37℃孵育10~30 min,室溫孵育10~20 min。PBS沖洗,2 min×3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37℃孵育10~30 min。PBS沖洗,2 min×3次。顯色劑顯色(DAB)。自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水透明、封片。

1.2.2 結(jié)果判斷及分析

光鏡下觀察肌間神經(jīng)叢的IGCs發(fā)育情況,四種免疫組化染色以腸肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽性,根據(jù)染色結(jié)果,作HE、NSE、PGP9.5、RET和EDNRB五個指標(biāo)的染色效果分析。RS Image成像系統(tǒng)照相,在RET和EDNRB切片中腸肌間神經(jīng)叢,分別10×和40×隨機存盤,每張切片在40×倍顯微鏡下隨機取5個視野,記數(shù)分析指標(biāo):肌間神經(jīng)叢RET和EDNRB蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)和神經(jīng)叢的數(shù)目,以個/叢為單位計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件單因素方差分析對腸肌間神經(jīng)叢表達(dá)RET和EDNRB的密度進行分析比較,檢驗水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)HE染色與免疫組化標(biāo)記對HD及HAD診斷的比較

分別對HD組和HAD組狹窄段腸管進行常規(guī)HE,結(jié)果先天性巨結(jié)腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)未見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,NID增生的神經(jīng)叢和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯增多,且大多呈未成熟狀態(tài),神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥神經(jīng)叢面積減小,叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大小基本正常見圖1。

圖1　正常對照組、HD組和HAD組狹窄段腸管HE染色(40×)A:先天性巨結(jié)腸;B:NID;C:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥

正常對照組、HD組和HAD組免疫組化標(biāo)記NSE的染色,結(jié)果正常對照組的正常腸壁可見神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿中表達(dá)為棕褐色,神經(jīng)纖維表達(dá)為棕褐色細(xì)波紋,施旺細(xì)胞及周圍細(xì)胞陰性HD組可見增生的肌間神經(jīng)叢纖維表達(dá)為棕褐色,未見神經(jīng)叢內(nèi)有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,NID增生的腸肌間神經(jīng)叢成串珠養(yǎng)排列,可見神經(jīng)纖維明顯增生,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞增多,腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥可見神經(jīng)叢面積減少,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少,大小正常見圖2。

圖2　正常對照組,HD組和HAD組狹窄段腸管NSE染色(40×)A:正常對照組;B:HD;C:NID;D:腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥

正常對照組、HD組和HAD組免疫組化標(biāo)記PGP9.5的染色,正常對照組腸壁肌間神經(jīng)叢中成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞漿和核中表達(dá)為棕黃色細(xì)顆粒,胞漿顆粒清晰,細(xì)胞核淡染、核仁明顯,HD肌間神經(jīng)叢見不到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,NID肌間神經(jīng)叢中未成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)為胞漿胞核皆濃染、結(jié)構(gòu)不清、無明顯核仁,腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥神經(jīng)叢面積明顯減少,可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大小明顯改變見圖3。

圖3　正常對照組,HD組和HAD組狹窄段腸管PGP9.5染色(40×)A:正常對照組;B:HD;C:NID;D:腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥

重復(fù)復(fù)習(xí)HE切片時診斷HD和HAD各16例,有8例切片HD和HAD的特征不很典型,歸為不明確組。經(jīng)PGP9.5 和NSE染色發(fā)現(xiàn)HD為21例,HAD為19例,其中IND16例, HP3例見表1。

2.2 正常對照組、HD組和HAD組的RET各段免疫組化標(biāo)記分布特點

每張切片在20×10倍顯微鏡下隨機取5個視野,光鏡下記數(shù),分析指標(biāo):肌間神經(jīng)叢RET蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)和神經(jīng)叢的數(shù)目,以個/叢為單位計數(shù),每張切片數(shù)3次,取平均數(shù),用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行方差分析。

表1　40例常規(guī)HE染色與免疫組化標(biāo)記診斷HD和HAD的結(jié)果

2.2.1 正常對照組、HD組和HAD組狹窄段RET免疫組化標(biāo)記分布特點

分別對正常對照組、HD組和HAD組狹窄段腸管進行RET標(biāo)記的免疫組化染色,了解其分布特點,結(jié)果正常對照組腸組織肌間神經(jīng)叢明顯,成團狀,叢中間縱橫連接成網(wǎng)絡(luò)狀的神經(jīng)纖維,淡黃,RET陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分散于其中。HD腸組織肌間神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)叢,無RET陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,僅見到增粗的網(wǎng)狀神經(jīng)纖維成淡黃色。IND腸組織間神經(jīng)叢增生,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少。腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥的肌間神經(jīng)叢明顯減少,可見RET陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分散于其中見圖4。并進行了各組狹窄段神經(jīng)叢細(xì)胞RET表達(dá)密度的比較,RET在HD狹窄段中表達(dá)較HAD和正常對照組減少(P<0.05)見圖5。

圖4　正常對照組、HD組和HAD組狹窄段RET免疫組化染色(40×)A:正常對照組;B:HD;C:NID;D:腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥

圖5　各組狹窄段神經(jīng)叢細(xì)胞RET表達(dá)密度比較注:與正常組相比,*P<0.05

2.2.2 正常對照組、HD組和HAD組的RET擴張段免疫組化標(biāo)記分布特點

對HD、HAD和正常組進行擴張段神經(jīng)叢細(xì)胞RET表達(dá)密度的比較,HD和HAD擴張段與正常組的RET表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)見圖6。

2.2.3 正常對照組、HD組和HAD組的狹窄段的EDNRB免疫組化標(biāo)記分布特點

分別對對照組、HD組和HAD組狹窄段腸管進行EDNRB標(biāo)記的免疫組化染色,了解其分布特點,結(jié)果正常對照組與HD 和HAD各組切片上RET與EDNRB免疫組化染色的描述,正常對照組EDNRB陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分散。HD組EDNRB陽性的細(xì)胞數(shù)量較少,IND腸組織肌間巨大神經(jīng)節(jié)圖中間神經(jīng)叢增生,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少。腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥的神經(jīng)叢面積減小,EDNRB陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分散于其中見圖7。并進行了各組狹窄段神經(jīng)叢細(xì)胞EDNRB表達(dá)密度的比較,EDNRB在HD狹窄段中表達(dá)較HAD和正常對照組減少(P<0.05)見圖8。

圖6　各組擴張段神經(jīng)叢細(xì)胞RET表達(dá)密度比較

圖7　正常對照組、HD組和HAD組狹窄段EDNRB免疫組化染色(40×)A:正常對照組;B:HD;C:NID;D:腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥

圖8　各組狹窄段神經(jīng)叢細(xì)胞EDNRB表達(dá)密度注:與正常組相比,*P<0.05

2.4 正常對照組、HD組和HAD組的擴張段的EDNRB免疫組化標(biāo)記分布特點

對HD、HAD和正常對照組進行擴張段神經(jīng)叢細(xì)胞RET表達(dá)密度的比較,HD和HAD擴張段與正常組的EDNRB表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意(P>0.05)見圖9。

圖9　各組擴張段神經(jīng)叢細(xì)胞EDNRB表達(dá)密度

用SPSS13.0對結(jié)果進行單因素方差分析,HD與HAD和正常組狹窄段的RET和EDNRB表達(dá)都有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05),相反,HD與HAD和正常對照組擴張段的RET和EDNRB表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意(P>0.05)。

3 討論

對于深入探討HD的發(fā)病機制產(chǎn)生了重要影響。從Valla的發(fā)現(xiàn)后,人們又發(fā)現(xiàn)有患者具有的典型HD臨床表現(xiàn)但腸壁間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存在,因而逐漸認(rèn)識到可有存在其他各種不同腸神經(jīng)系統(tǒng)異常,于是提出了HAD的概念。一般認(rèn)為,HD確診關(guān)鍵是觀察狹窄段(即病變結(jié)腸)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的有無。HAD在診斷分類上則一直存在爭論。國內(nèi)現(xiàn)主要將HAD分類為IND、HP、腸神經(jīng)發(fā)育不良。HAD和HD統(tǒng)稱為IDs。

3.1 HD和HAD的診斷

HD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為病理診斷?，F(xiàn)在國內(nèi)多采取的是單純的HE染色診斷,這樣的診斷方法雖對于有經(jīng)驗的病理醫(yī)師診斷典型的HD是可行的,但也存在一定的局限性。HE染色神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)與膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞不易鑒別,加上炎癥細(xì)胞的影響,使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不易明確觀察到[13],在一些不太典型的情況下就需進行免疫組化染色以協(xié)助診斷。本實驗從現(xiàn)在常用的免疫組化方法中選取了PGP9.5和NSE協(xié)助診斷。PGP9.5是一種對粘膜肌層和固有層中異常膽堿能神經(jīng)染色的神經(jīng)元標(biāo)志物,存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的各個水平及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中,表現(xiàn)為黃褐色團塊狀的神經(jīng)叢中散在分布深褐色神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,在神經(jīng)膠質(zhì)中細(xì)胞不表達(dá)。雖然PGP9.5的表達(dá)特異性好,但PGP9.5在腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(intestinal ganglion cell,IGCs)的表達(dá)有所不同。PGP9.5在IGCs的胞漿和胞核表達(dá)為棕黃色細(xì)顆粒,成熟的節(jié)細(xì)胞中胞漿顆粒清晰,細(xì)胞核淡染,核仁明顯。未成熟的節(jié)細(xì)胞胞漿、胞核皆深染,結(jié)構(gòu)不清,無明顯核仁。神經(jīng)叢內(nèi)其他細(xì)胞和叢周圍細(xì)胞陰性。NSE是一種糖酵解酶,在神經(jīng)母細(xì)胞分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞后,NSE也由非神經(jīng)元特異性烯醇化酶轉(zhuǎn)變而來。因此可作為神經(jīng)元發(fā)育成熟的標(biāo)志物,用標(biāo)記的抗NSE抗體與標(biāo)本中NSE結(jié)合,可顯示腸神經(jīng)組織。有學(xué)者的研究表明,作為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)志物,NSE免疫組織化學(xué)技術(shù)能使神經(jīng)組織清晰可見,即使新生兒粘膜下層發(fā)育不夠成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞也容易辨認(rèn)。神經(jīng)組織的特異性著色,能夠避免出現(xiàn)HE染色時與炎性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴濾泡相混淆的問題,提高診斷HD的準(zhǔn)確率。NSE在節(jié)細(xì)胞胞漿中表達(dá)為棕褐色,神經(jīng)纖維表達(dá)為棕褐色細(xì)波紋,施旺細(xì)胞及周圍細(xì)胞中表達(dá)為陰性[14]。

本研究先用HE染色對巨結(jié)腸術(shù)后病例進行診斷,發(fā)現(xiàn)在腸肌間神經(jīng)叢中有一些未成熟的腸肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞不能很好區(qū)分,造成有8例患者診斷困難。在行PGP9.5和NSE后,能判斷出腸肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞,故能明確診斷。所以,在HD和HAD的診斷中,應(yīng)適當(dāng)?shù)脑黾用庖呓M化染色。而PGP9.5和NSE的免疫組化技術(shù)是一種可靠的方法,在各種腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常疾病的形態(tài)學(xué)研究和臨床診斷中有重要的臨床意義。

3.2 RET在HD和HAD的腸壁表達(dá)情況

ret基因定位于染色體10q11.2區(qū)域[1],ret基因編碼的RET蛋白為114個殘基跨膜蛋白,有一個富含半光氨酸激酶的細(xì)胞區(qū)。激活RET受體需要和它的配體結(jié)合形成復(fù)合體,而RET配體是由GDNF和GFRα1結(jié)合形成的。ret基因和gfrα1基因在腸神經(jīng)系統(tǒng)要進入消化道時表達(dá),而gdnf則當(dāng)腸神經(jīng)系統(tǒng)遷移至食管時在胃中表達(dá)[2]。ret、gdnf或gfrα1突變的小鼠,腸神經(jīng)系統(tǒng)將不能存在于從食管開始的大部分消化道,這種腸神經(jīng)元的缺失可能是由于神經(jīng)細(xì)胞凋亡或移植的失敗[3]。Schuchardt[4]等敲除斑馬魚和小鼠ret基因后,發(fā)現(xiàn)其腸道出現(xiàn)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失。Shepherd[5]通過對ret基因突變的小鼠研究發(fā)現(xiàn),ret純合子突變的小鼠出生后很快死亡,解剖發(fā)現(xiàn)其全消化道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失。實驗證實gdnf基因雜合突變的小鼠大約有50%出現(xiàn)腸神經(jīng)元的減少[6],推測可能由于腸神經(jīng)元增殖減少和腸神經(jīng)元遷移推遲引起[7]。體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)GDNF是一個啟動腸神經(jīng)系統(tǒng)的化學(xué)信號,推測GDNF可能啟動RET和GFRα1表達(dá),促使腸神經(jīng)系統(tǒng)遷移到消化道中。綜上所述,推測GDNF-RET-GFRα1信號通路對腸神經(jīng)系統(tǒng)的存活、增殖和遷移有重要作用。

本研究觀察RET在HD和HAD患者腸壁表達(dá)分布情況,并與正常結(jié)腸對照,發(fā)現(xiàn)RET在部分HD患者的狹窄段的腸肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)異常,而在HD的擴張段及HAD的各段的RET表達(dá)差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義?？梢猿醪酵茰yret基因?qū)δc神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)有影響,可能引起腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺失。而ret基因可能對于HAD的腸神經(jīng)變化影響不是很明顯。

3.3 EDNRB在HD和HAD的腸壁表達(dá)情況

研究證實另一個對腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有重要影響的途徑是血管內(nèi)皮素途徑(EDN3-EDNRB途徑)。edn3基因?qū)儆诓溉閯游镏幸阎猠dn基因家族中的成員。edn3基因編碼238個氨基酸的前體物質(zhì),定位于人染色體20q13.2-13.3。EDN3對后腸神經(jīng)細(xì)胞定植有重要作用,它的作用機制現(xiàn)在仍存在爭論。其中一種主要的觀點是EDN3通過抑制腸神經(jīng)前體細(xì)胞的分化,促進腸神經(jīng)前體細(xì)胞增殖來保持腸神經(jīng)前體細(xì)胞庫的數(shù)量。EDN3失活將使細(xì)胞增殖減少和前體細(xì)胞過早的分化,最后導(dǎo)致沒有足夠的祖細(xì)胞到后腸[8]。EDN3促進腸神經(jīng)系統(tǒng)的增殖得到很多科研小組支持[9]。Nandor[10]敲除雞edn3基因也得到了后腸腸神經(jīng)元缺失的模型。ednrb基因位于13q22,約24 kb,含7個外顯子和6個內(nèi)含子,其編碼產(chǎn)物為具有442個氨基酸的蛋白質(zhì),該基因被認(rèn)為是僅次于ret基因的HD重要易感基因[11],EDNRB屬于G蛋白偶聯(lián)受體,與配體結(jié)合被激活后,誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流入細(xì)胞,在胚胎發(fā)育期間,調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞與腸間充質(zhì)細(xì)胞的相互作用,使神經(jīng)嵴細(xì)胞可以正常發(fā)育、分化和遷移。而且表達(dá)EDNRB的內(nèi)皮細(xì)胞參與內(nèi)皮素激活一氧化氮合酶的過程,EDNRB在腦、腎、肺和心臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。最近發(fā)現(xiàn)其也存在結(jié)腸內(nèi),尤其是在肌間神經(jīng)叢、粘膜下層及粘膜下的血管組織內(nèi)。EDN3 與EDNRB結(jié)合,組成EDN3-EDNRB內(nèi)皮素信號傳導(dǎo)通路[12]。

本研究觀察EDNRB在HD和HAD患者腸壁表達(dá)分布情況,與正常結(jié)腸對照,發(fā)現(xiàn)EDNRB在部分HD患者的狹窄段的腸肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)異常,而在HD的擴張段及HAD的各段的EDNRB表達(dá)差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。可以初步推測ednrb基因?qū)δc神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)有影響,可能引起腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺失。而ednrb基因可能對于HAD的腸神經(jīng)變化影響不是很明顯。

綜上所述,RET和EDNRB在HD狹窄段中表達(dá)有異常,是狹窄段中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失的一個因素,推測RET和EDNRB 與HD的發(fā)生有一定關(guān)系。RET和EDNRB在HAD的腸壁表達(dá)未見明顯異常,提示與HAD的發(fā)病關(guān)系不是很密切。HD 和HAD雖同為腸神經(jīng)系統(tǒng)異常,但RET和EDNRB的表達(dá)卻不相同,提示其在發(fā)病機制上也可能存在各自的特點。目前還發(fā)現(xiàn)了不少HD的易感基因,也許可以在這些易感基因中找到與HAD發(fā)生相關(guān)的基因。RET和EDNRB在HD和HAD患者腸壁表達(dá)上的差異,也許可以作為它們診斷新的方向。

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Expression of ret and ednrb in intestinal wall of Hirschsprung's disease and Hirschsprung's allied disease patients

Zhang Yi-xian1,Zhang Li-bing1,Yan Huan1,Zhong Lin2△
(1.Surgical Department,Chengdu Women and Children’s Central Hospital,Sichuan Chengdu 610000; 2.Pediatric Surgical Department,West China Hospital,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041)

Abstract Objective:Through comparing the expression of ret and ednrb gene in the intestinal wall of patients with Hirschsprung’s disease and Hirschsprung’s allied disease,to investigate the differences between HD and HAD’s pathogenesy and indicate the potential direction of HD and HAD’s diagnosis and treatment.Meanwhile,to collect further information of the value of the immunohistochemistry in diagnosis of HD and HAD.Methods:Reviewed the HE slides of the patients who suffered the resection of megacolon under the inverted light microscope,diagnosed primarily and divided into groups by character of intestine wall.The PGP9.5 and NSE immunohistochemistry assays were used to diagnose the cases secondly.The expression of ret and ednrbin gene in each group was detected by the immunohistochemistry assay.Results:Eight cases which were indeterminately diagnosed by HE,definitively diagnosed by immunohistochemistry.Ret was low expressed in HD stegnosis,compared with HAD and control groups (P<0.05).Ednrbwas low expressed in HD stegnosis,compared with HAD and Control groups(P<0.05).No expression difference of ret and ednrbin gene between HD and HAD extensive intestine and normal intestine.Conclusion:The immunohistochemistry assay could assist the diagnosis of HD and HAD.The abnormal expression ret and ednrbin gene in HD stegnosis,indicated those two genes may have the potential relationship with occurrence of HD.

Key Words:Hirschsprung’s disease;Hirschsprung’s allied disease;PGP9.5;NSE;RET;EDNRB;Immunohistochemistry

(收稿日期：2015-10-12)

通訊作者:△鐘麟,男,主任醫(yī)師,主要從事小兒外科臨床診治工作, Email:zhonglin123@163.com。

作者簡介:張怡先,女,住院醫(yī)師,主要從事小兒外科臨床診治工作, Email:hxxianxian@163.com。