氧化白藜蘆醇體內(nèi)外抑制小鼠肉瘤S180的作用初步研究

陳夏靜熊堯任為許可 周黎明△(.成都市婦女兒童醫(yī)院藥劑科,四川成都 6009; .四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院,四川成都6004)

氧化白藜蘆醇體內(nèi)外抑制小鼠肉瘤S180的作用初步研究

陳夏靜1熊堯2任為2許可 周黎明2△
(1.成都市婦女兒童醫(yī)院藥劑科,四川成都 610091; 2.四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院,四川成都610041)

摘要目的:研究氧化白藜蘆醇在體外對腫瘤細胞株以及小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用。方法:采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測氧化白藜蘆醇對人的各種腫瘤細胞株體外增殖的抑制作用,并計算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。建立小鼠S180肉瘤移植瘤模型,分為對照組、環(huán)磷酰胺組、氧化白藜蘆醇80、40、20 mg·kg-1劑量組,以實體瘤瘤塊重量及抑瘤率為指標(biāo)評價氧化白藜蘆醇對小鼠移植瘤生長的抑制作用,并計算其胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。結(jié)果:MTT結(jié)果顯示,氧化白藜蘆醇對K562,SK-OV-3,MCF -7,SMMC-7721,A549,HNE-1和SW-480細胞株IC50值分別為52.88±3.21,11.55±5.42,23.61±2.13,58.13±4.84,7.44 ±2.94,67.73±7.23和62.86±5.2μg·ml-1,有較好的抑制腫瘤細胞體外生長作用。體內(nèi)試驗顯示氧化白藜蘆醇對移植瘤的抑制作用明顯,80、40、20 mg·kg-1三個劑量組對S180移植瘤抑制率為77.78%,61.43%和38.56%,呈一定量效關(guān)系,并對胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)影響不大。

關(guān)鍵詞:氧化白藜蘆醇;人腫瘤細胞株;S180

Key Words:Parthenolide;PC-3;Apoptosis;Bax mRNA;Bcl-2 m RNA Oxyresveratrol;Cancer cell line;S180

氧化白藜蘆醇(Oxyresveratrol)是一種天然活性物質(zhì),存在于多種植物中,可從桑科Moraceae,桃金娘科Myrtaceae,百合科Liliaceae,買麻藤科Gnetaceae等植物中提取。文獻報道其有抗病毒,抗氧化等作用,體外實驗證實氧化白藜蘆醇為酪氨酸酶抑制劑,可抑制嗜堿性細胞組胺釋放;對于平滑肌的收縮亦有抑制作用。白藜蘆醇具有抑制腫瘤細胞作用已有大量的報道,從化學(xué)結(jié)構(gòu)上講,氧化白藜蘆醇與白藜蘆醇有相同的主要結(jié)構(gòu),為此,我們用細胞株在體外測試其抑制腫瘤細胞株的作用,在體內(nèi)用小鼠S180模型研究其抑制腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與動物

人白血病細胞株K562,人卵巢癌細胞SK-OV-3,人乳腺癌細胞MCF-7,人肝癌細胞SMMC-7721,人肺癌細胞A549,人鼻咽癌細胞HNE-1,人結(jié)腸癌細胞SW480,購自上海細胞庫,由四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室凍存。鼠源性S180肉瘤細胞,均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心并由本實驗室保存。昆明種小鼠,雄性,體重18~22 g,共150只,動物合格證SCXK(川)2008-24,購自成都達碩生物科技有限公司。

1.1.2 藥物與試劑

試驗化合物:氧化白藜蘆醇,純度≥98%,(HPLC)由四川大學(xué)華西藥學(xué)院王峰鵬教授提供;注射用鹽酸多柔比星(阿霉素),浙江海正藥業(yè)股份有限公司,批號090204A。RPMI-1640培養(yǎng)基,成都哈里生物公司;小牛血清,批號090625,成都哈里生物公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT),Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO),天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;臺盼藍,Sigma公司;胰蛋白酶,成都哈里生物公司。環(huán)磷酰胺粉針劑,購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號11030621

1.1.3 儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱,日本SANYO公司;超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;全自動酶標(biāo)儀,型號DNM9602G,北京普朗新技術(shù)有限公司;細胞培養(yǎng)瓶,NEST96孔培養(yǎng)板。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗檢測IC50值

收集對數(shù)生長期細胞,加入96孔板,每孔加入100μl細胞懸液,每孔細胞數(shù)為優(yōu)化后數(shù)量(約5×103個·孔),邊緣孔用無菌PBS溶液填充,待細胞貼壁后,設(shè)置試驗藥物組,加入終濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5125μg·ml-1氧化白藜蘆醇;陽性對照組,加入終濃度為32、16、8、4、2、1、0.5μg· ml-1的多柔比星;用藥組每個濃度設(shè)3個復(fù)孔,再設(shè)置不含細胞的完全培養(yǎng)基為空白組;以及未經(jīng)藥物處理的正常培養(yǎng)細胞作為陰性對照組,終體積均為200μl。孵育48 h后,吸棄含藥物的RPMI-1640培養(yǎng)基,每孔加入100μl無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基、20μl濃度為5 mg·ml-1的MTT溶液,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液及MTT溶液;每孔加入100μl二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩至紫色結(jié)晶物充分溶解,在全自動酶標(biāo)儀上測定OD570 nm處的吸光值,同時以等體積的空白DMSO設(shè)定調(diào)零孔。細胞生長抑制率=(1-OD樣品/OD陰性)×100%。

1.2.2 體內(nèi)抑制小鼠S180肉瘤的生長

移植性S180肝癌細胞的小鼠腹水接種腋下制備小鼠荷瘤模型,待試驗小鼠接種1天后,按隨機數(shù)字表示將小鼠分為5 組,每組10只:腹腔注射給予環(huán)磷酰胺溶液60mg·kg-1小鼠體重,每周給藥1次,共計給藥2次;氧化白藜蘆醇80、40、20 mg·kg-1三組,給藥方式均為腹腔注射。陰性對照組為注射等體積的生理鹽水;陰性對照組及氧化白藜蘆醇組皆按照每天注射1次,每周注射6次,共計注射12次給藥,連續(xù)飼養(yǎng)14 d。每天觀察,測量并記錄小鼠體重、瘤徑及死亡情況,計算小鼠死亡率,死亡率=(各組死亡動物數(shù)量/各組動物總數(shù))× 100%。于末次給藥24 h后,脫頸椎處死小鼠,剝離腫瘤,取脾臟及胸腺分別稱重,計算腫瘤抑制率,腫瘤抑制率(%)=[1-(平均實驗組瘤重/平均陰性對照組瘤重)]×100%,免疫臟器系數(shù),脾臟(胸腺)系數(shù)=[脾臟(胸腺)重量(mg)/體重(g)]× 100%。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0進行統(tǒng)計分析,實驗結(jié)果以±SD表示。實驗采用單因素方差分析及t檢驗進行比較分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧化白藜蘆醇在體外對各個細胞株的IC50值

表1　氧化白藜蘆醇體外對腫瘤細胞生長抑制作用

從表1可以看出,氧化白藜蘆醇體外對各種腫瘤細胞有生長抑制作用

2.2 氧化白藜蘆醇體內(nèi)抑制小鼠S180肉瘤的作用

表2　氧化白藜蘆醇抑制小鼠S180肉瘤的作用(±SD,n=10)

表2　氧化白藜蘆醇抑制小鼠S180肉瘤的作用(±SD,n=10)

注:與陰性對照組相比**P<0.01;*P<0.05。

組別　　劑量mg·kg-1體重(g)給藥前　　給藥后瘤重(g)抑瘤率(%)陰性對照組　- 21.44±2.84 35.13±4.31 1.53±0.72　 -環(huán)磷酰胺組　60 21.43±1.88 28.32±2.75*0.21±0.10**81.69高劑量組 　80 20.28±2.72 33.19±3.67 0.34±0.11**77.78中劑量組 　40 21.79±1.43 34.09±4.12 0.59±0.19*61.43低劑量組 　20 21.50±2.43 35.89±4.62 0.94±0.45*38.56

由表2可以看出,氧化白藜蘆醇在高(80 mg·kg-1)、中(40 mg·kg-1)、低(20 mg·kg-1)三個劑量組下均表現(xiàn)出對小鼠S180移植瘤具有抑制作用,且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,實驗藥物組腫瘤的平均重量明顯低于陰性組;氧化白藜蘆醇在高、中、低三個劑量組作用后的腫瘤抑制率分別為77.78%、61.43%和38.56%,且結(jié)果與陰性組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05。實驗結(jié)果中,陽性藥環(huán)磷酰胺組抑制腫瘤效果表現(xiàn)良好,表明實驗結(jié)果具有可靠性。

2.3 氧化白藜蘆醇對荷瘤小鼠的免疫器官的影響

表3　氧化白藜蘆醇在荷瘤小鼠的免疫器官的影響(±SD,n=10)

表3　氧化白藜蘆醇在荷瘤小鼠的免疫器官的影響(±SD,n=10)

注:與陰性對照組相比,**P<0.01,*P<0.05。

組別　　劑量mg·kg-1體重(g)給藥前體重(g)給藥前胸腺指數(shù)mg·g-1脾臟指數(shù)mg·g-1陰性對照組　-　 21.44±2.84 35.13±4.31　 2.34±0.59　 12.95±5.34環(huán)磷酰胺組　60　 21.43±1.88 28.32±2.75*1.74±0.43**9.67±2.13*高劑量組 　80　 20.28±2.72 33.19±3.67　 2.14±0.37　 10.98±2.18中劑量組 　40　 21.79±1.43 34.09±4.12　 2.17±0.49　 10.89±2.59低劑量組 　20　 21.50±2.43 35.89±4.62　 2.06±0.82　 13.64±3.84

由表3可以看出,環(huán)磷酰胺組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與陰性對照組比較有顯著性差異,而氧化白藜蘆醇高中低劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與與陰性對照組比較無顯著性差異。說明氧化白藜蘆對免疫器官的抑制作用不嚴重

3 討論

氧化白藜蘆醇是白藜蘆醇的衍生物。白藜蘆醇的抗腫瘤作用已得到廣泛的研究[1],白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病等作用,同時發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可減輕化療藥物的外周神經(jīng)毒性和肝臟毒性作用,常被用作腫瘤化療的輔助用藥。另外,在多種類型的腫瘤細胞中,白藜蘆醇具有放療增敏的作用。而目前因其抗腫瘤的作用日益受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。國內(nèi)外多項研究表明,白藜蘆醇對鼻咽癌、肺癌、肝癌、腸癌、胃癌、乳腺癌、白血病、甲狀腺癌等均有拮抗作用,但由于白藜蘆醇的水溶性較差,成藥較難,為此水溶性較好的氧化白藜蘆醇的抗腫瘤作用得到了一定的研究,2010年Huang等報道,氧化白藜蘆醇的衍生物于人口腔表皮樣癌細胞,人乳腺癌細胞以及肺癌細胞等均表現(xiàn)出細胞毒性作用,并且其效力等同于阿霉素及玫瑰樹堿[7],提示氧化白藜蘆醇在抗癌方面的應(yīng)用潛能。本研究從氧化白藜蘆醇在體內(nèi)外抑制腫瘤細胞株的增殖作用入手,繼而測試其對小鼠的肉瘤抑制作用,通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)氧化白藜蘆醇具有較好的體外抗腫瘤細胞增殖作用,能在較低濃度下抑制不同人腫瘤細胞的生長作用,建立移植性S180小鼠模型評價了氧化白藜蘆醇體內(nèi)抗腫瘤作用,結(jié)果顯示氧化白藜蘆醇在體內(nèi)也能產(chǎn)生較好的腫瘤生長抑制作用,且較陽性藥環(huán)磷酰胺對小鼠免疫臟器及體重影響較小。關(guān)于氧化白藜蘆醇的抑制腫瘤的生長作用機制,我們發(fā)現(xiàn)它有誘導(dǎo)凋亡和自噬的作用(本文沒顯示數(shù)據(jù)),其詳細的作用機制仍在進一步研究中。我們相信隨著對氧化白藜蘆醇的研究越多,其成藥的可能性越大。

參考文獻

1 Jang M,Cai L,Udeani GO,et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol,a natural product derived from grapes[J].Science, 1997,275(5297):218-220.

[2] Schwingel TE,Klein CP,Nicoletti NF,et al.Effects of the compounds resveratrol,rutin,quercetin,and quercetin nanoemulsion on oxaliplatin-induced hepatotoxicity and neurotoxicity in mice[J]. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol,2014,387(9):837-848.

[3] 楊壹羚.白藜蘆醇在腫瘤放療增敏機制中的研究進展[J].中國實驗診斷學(xué),2014,18(5):861-863.

[4] 白楊,潘雋麗,蘇薇薇.白藜蘆醇與白藜蘆醇甙的研究進展[J].中藥材,2004,27(8):55-58.

[5] Shin A,Davis FB,Lin HY,et al.Resveratrol induces apoptosis in thyroid cancer cell lines via a MAPK-and p53-dependent mechanism [J].J Clin Endocrinol Metab,2002,87(3):1223-1232.

[6] 田雪梅,張展霞.白藜蘆醇抗腫瘤作用的體外實驗研究[J].中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2000,39(6):64-68.

[7] Huang HL,Chen GT,Lu Z,et al.Identification of seven metabolites of oxyresveratrol in rat urine and bile using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Biomed Chromatorgr,2010,24 (4):426-432.

臨床論著

Study on tumor cell proliferation activity of oxyresveratrol in vitro and in vivo

Chen Xia-Jing1,Xiong Yao2,Ren Wei2,Xu Ke2,Zhou Li-Ming2△
(1.Department of Pharmacy,Chengdu Women& Children's Center Hospital,Sichuan Chengdu 610091; 2.Department of Pharmacology,Preclinical and Forensic Medical School,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041)

Abstract Objective:To investigate the inhibitory effect of oxyresveratrol on cancer cell line and sarcoma S180 of mouse.Methods:MTT assay was used to detect the inhibitory effect of oxyresveratrol on human cancer cell line proliferation in vitro.Sarcoma S180 of mouse model was performed to observe the anti-cancer activity of oxyresveratrol in vivo.Animals were divided into five groups including:negative control group,CTX group and three groups treated with oxyresveratrol at the dose 80,40,20 mg·kg-1. The inhibitory effect of oxyresveratrol in vivo was evaluated by tumor size and inhibitory rates.Results:MTT assays showed that the IC50of oxyresveratrol for the K562,SK-OV-3,MCF-7,SMMC-7721,A549,HNE-1 and SW-480 were 52.88±3.21, 11.55±5.42,23.61±2.13,58.13±4.8,7.44±2.94,67.73±7.23和62.86±5.2μg·ml-1 respectively.Oxyersveratrol of 80,40, 20mg·kg-1had significant inhibitory effects and dose-dependent effects on growth of tumor,the inhibitory rates of tumor were 77.78%,61.43%(P<0.01),61.43%(P<0.05)and 38.56%.Oxyresveratrol have obvious anti-tumor activities both in vivo and in vitro.

(收稿日期：2015-10)

通訊作者:△周黎明,女,教授,主要從事抗腫瘤藥物研究,Email: zhou108@163.com。

作者簡介:陳夏靜,女,主要從事臨床藥學(xué)工作,Email:93430478@qq. com。