儲存條件對全血樣本他克莫司血藥濃度監(jiān)測的影響

西娜 劉超

儲存條件對全血樣本他克莫司血藥濃度監(jiān)測的影響

西娜 劉超

目的 考察兩種儲存條件對全血樣本他克莫司血藥濃度監(jiān)測結(jié)果的影響。方法 采集臨床腎移植術(shù)后患者口服他克莫司后12 h靜脈全血樣本20份，分別在室溫(25℃)和冰箱冷藏(4℃)避光儲存，用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測定0、24、72 h時他克莫司的血藥濃度。結(jié)果 全血樣本在兩種儲存條件下72 h內(nèi)，他克莫司的血藥濃度無顯著性變化(P＜0.05)，RSD＜5%。結(jié)論 他克莫司全血標本在室溫(25℃)和冰箱冷藏(4℃)避光儲存72 h內(nèi)保持穩(wěn)定，不影響測定結(jié)果，故因特殊情況不能及時送檢的樣品在上述兩種儲存條件下72 h內(nèi)仍有檢測價值。

他克莫司;血藥濃度監(jiān)測;儲存條件;全血

他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)系從放射花線菌的發(fā)酵液中提取的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是第二代免疫抑制藥的代表性藥物，廣泛用于器官移植的抗排斥反應(yīng)，如肝移植、腎移植、肺移植、角膜移植等，具有藥效強、使用劑量低、器官存活率高、急性排斥反應(yīng)發(fā)生率低等特點［1］。研究證實，F(xiàn)K506在體內(nèi)和體外抑制淋巴細胞活性的能力比環(huán)孢素強10～100倍，且應(yīng)用其防止排斥反應(yīng)的有效劑量不到環(huán)孢素的1/100～1/10［2］。但它口服吸收生物利用度及藥物動力學(xué)個體差異較大，導(dǎo)致個體濃度波動較大［3］。FK506濃度過高時易導(dǎo)致毒性產(chǎn)生如神經(jīng)毒性、腎毒性和高血糖發(fā)生［4］，過低時易并發(fā)急性排斥反應(yīng)［5］。因此需對其進行治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring，TDM)，以使免疫抑制藥的安全性和療效達到最優(yōu)化［6］，減少醫(yī)生僅憑借臨床經(jīng)驗及患者用藥反應(yīng)來調(diào)整給藥劑量帶來的盲目性［7］。來中國人民解放軍第309醫(yī)院進行移植術(shù)后FK506血藥濃度監(jiān)測的外地患者占很大比例，因血液成分復(fù)雜，故未離心處理的全血樣本在放置一段時間后，其檢測結(jié)果的準確性是否受到影響是一個必須要面對的問題。許多患者紛紛咨詢血樣是否必須在取血當天測定，其保存溫度有何特殊要求等等，為給患者一個科學(xué)、滿意的答復(fù)，我們對他克莫司全血樣本保存的穩(wěn)定性進行了考察，報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 ARCHITECT i1000型全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國Abbott公司);XSYSTEMS 9527-26離心機(SIGMA公司);Mixmate渦旋混勻儀(EPPENDORF公司);BE-2011振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造廠);美菱BCD-205L3C冰箱(合肥美菱股份有限公司);EN05239微量加樣器100 μl(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 試劑 ARCHITECT 1L77他克莫司專用試劑盒(美國 Abbott公司，批號 29268M500);ARCHITECT 1L77他克莫司專用試劑盒定標液(美國Abbott公司，批號29268M500);ARCHITECT 1L77-55他克莫司全血沉淀劑20.4 ml(美國Abbott公司，批號308518);1P05-10雅培免疫抑制劑-復(fù)合質(zhì)控品2 ml(美國Abbott公司，批號47k14313)。

1.3 方法

1.3.1 儀器檢查校正:按照ARCHITECT i1000操作手冊開機自檢。

1.3.2 FK506全血藥物濃度的測定及質(zhì)量控制。

1.3.2.1 樣本采集:FK506全血藥物谷濃度的樣本采集應(yīng)于患者末次服用FK506后12 h進行［8］，血液樣本取自腎移植術(shù)后患者外周靜脈，樣本采集量不少于2 ml，置于EDTA-K2抗凝管中。

1.3.2.2 樣本測定:全血樣本搖勻后，精密吸取血樣200 μl置于離心管中，加入蛋白沉淀劑 200 μl，于渦旋振蕩器上振蕩10 s，再用高速離心機以13 000 r/min(離心半徑8 cm)離心4 min，取上清液至樣品管，再渦旋振蕩10 s，放入ARCHITECT i1000中進行檢測。

1.3.2.3 儀器定標與精密度試驗:試驗前對ARCHITECT i1000全自動免疫分析儀的FK506試劑盒定標，定標濃度分別為 0、3、6、12、20、30 ng/ml，儀器通過定標并自動生成標準曲線。連續(xù)5 d對隨行質(zhì)控進行測定，質(zhì)控品分為低(4.64 ng/ml)、中(8.81 ng/ml)、高(16.80 ng/ml)3個濃度。

1.3.2.3.1 日內(nèi)精密度:分別吸取3個濃度的全血質(zhì)控樣本，按“2.2.2”項下方法進行測定。每個濃度的質(zhì)控樣本經(jīng)處理后各進樣5次，記錄數(shù)值，求出平均值、SD及RSD，計算日內(nèi)精密度。

1.3.2.3.2 日間精密度:分別吸取3個濃度的全血質(zhì)控樣本，按“2.2.2”項下的方法進行測定。每個濃度的質(zhì)控樣本經(jīng)處理后于5 d內(nèi)分5次進樣，記錄數(shù)值，求出平均值、SD及RSD，計算日間精密度。

1.3.2.4 實驗分組與血樣儲存穩(wěn)定性研究:隨機抽取40份來我院需監(jiān)測FK506濃度的腎移植術(shù)后患者的全血樣本，其中男23份，女17份;年齡24～65歲。隨機均分為2組，每組20份樣本。取血當天測全血藥物濃度，再將1～20號樣本常溫(25℃)避光放置24 h、72 h，21～40號樣本于冰箱冷藏室(4℃)避光放置24 h、72 h，按“2.2.2”項下方法測定每個樣本放置24 h與72 h后的FK506濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，將1～40號樣本24、72 h的測定結(jié)果與0 h的測定結(jié)果分別進行雙側(cè)配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 儀器定標 標準曲線方程為:y=4.8×10512727x，相關(guān)系數(shù)r=0.9980，相關(guān)性佳。

2.2 精密度試驗 在標準曲線范圍內(nèi)，全血中他克莫司3個濃度的質(zhì)控樣本測定結(jié)果如下表，RSD均＜5%，符合2010年版《中國藥典》對生物樣品檢測相對標準偏差應(yīng)＜15%的要求。見表1、2。

2.3 血樣儲存穩(wěn)定性研究 常溫組(1～20號樣本)與冷藏組(21～40號樣本)在儲存24、72 h后他克莫司血藥濃度的RSD均＜15%，有臨床參考意義。常溫組與冷藏組共40個樣本在同一條件儲存不同時間，其測定結(jié)果差異均無顯著性差異(P＞0.05)，顯示樣品穩(wěn)定，對臨床因特殊情況不能及時送檢的樣品在上述兩種儲存條件下72 h內(nèi)仍有檢測價值。見表3、4。

表1 全血中他克莫司濃度測定日內(nèi)精密度考察結(jié)果

表2 全血中他克莫司濃度測定日間精密度考察結(jié)果

表3 他克莫司全血樣本25℃、4℃條件下儲存的濃度變化

3 討論

目前FK506血藥濃度監(jiān)測方法有微粒子酶免疫法(MEIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、酶放大免疫法(EMIT)、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(CMIA)和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)等。CMIA法是用于FK506血藥濃度監(jiān)測的最新方法。它是將化學(xué)發(fā)光原理與競爭性免疫測定相結(jié)合形成的分析技術(shù)，同時具有化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和免疫測定的特異性，分析不受樣品中高濃度的血紅蛋白、脂類、膽紅素的影響，與其他方法的相關(guān)性好，適合臨床常規(guī)監(jiān)測使用［9］，具有特異性好、敏感性高、可定量、全自動操作、重復(fù)性好等優(yōu)點［10］。作為全軍移植中心，我院移植患者數(shù)量較多，CMIA法的檢測范圍較大，比較適合我院使用。

表4 他克莫司全血樣本25℃、4℃保存時血藥濃度穩(wěn)定性的t檢驗結(jié)果 n=20

檢測他克莫司血藥濃度時，通常采用全血來做為檢測標本，這是因為:(1)全血/血漿中他克莫司濃度的分布為20∶1，全血中藥物濃度較高，更易達到檢測靈敏度要求;(2)血漿濃度穩(wěn)定性高，但比全血濃度變異性大;(3)患者個體差異較大，血藥達峰時間并不一致，故他克莫司血藥濃度監(jiān)測為全血谷值濃度，采血時間便于掌握且波動較小，所以臨床檢測一般不用血漿而以全血為主［11］。

在臨床治療藥物劑量調(diào)整時，醫(yī)生需要綜合考慮患者的病理狀態(tài)、生理生化指標及體內(nèi)藥物濃度之間的相關(guān)性來做出準確的判斷，而治療藥物監(jiān)測所提供的血藥濃度的準確性是做出這種正確判斷的基礎(chǔ)。因此，我們認為需要建立良好的質(zhì)量控制標準、可行的質(zhì)量控制評價，避免或減少由于測定本身帶來的誤差。故實驗前進行了儀器定標與精密度試驗，結(jié)果顯示低、中、高3個濃度的RSD均小于5%，符合2010年版《中國藥典》對生物樣品檢測相對標準偏差應(yīng)小于15%的要求，亦確保本實驗數(shù)據(jù)可靠。

經(jīng)筆者檢索相關(guān)文獻，口服他克莫司患者的全血標本在不同儲存條件下的穩(wěn)定性考察尚未見報道。通常我們收到樣本后會盡快檢測，以免影響濃度測定結(jié)果。而本研究結(jié)果表明，全血標本在室溫(25℃)和冰箱冷藏(4℃)儲存72 h內(nèi)，所測定的他克莫司血藥濃度結(jié)果無顯著性差異(P＞0.05)，為臨床儲存他克莫司全血標本的條件提供了實驗參考依據(jù);并提示日常監(jiān)測時我們可在保證結(jié)果準確的前提下靈活掌握測定時間，外地患者也可根據(jù)實際情況靈活選擇送血樣的時間和方式，不必急于當天將樣品送到實驗室進行測定。對于其他季節(jié)的不同室溫以及更長時間對他克莫司血藥濃度測定的影響將會在今后的工作中進一步考察。

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R 914.1

A

1002-7386(2015)18-2849-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．18．046

100091 北京市，中國人民解放軍第309醫(yī)院藥劑科(西娜);河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系(劉超)

2015-03-18)