三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

李世英，謝云亮，于忠慧

三七(panax notoginseng)為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，應用歷史悠久，主產于云南、廣西等省份，具有消腫定痛和活血化瘀等功效，臨床上主要用于心絞痛、冠心病等心血管系統(tǒng)疾病的防治［1］。三七的主要活性成分包括皂苷、黃酮、多糖等，其中皂苷類成分研究的最為系統(tǒng)，而其它活性成分的研究報道較少［2］。三七多糖的活性研究主要集中在免疫調節(jié)及降血糖等方面，關于三七多糖在腦缺血再灌注方面的研究未見報道［3，4］。因此，本研究通過三七多糖預處理大鼠后，建立腦缺血再灌注損傷模型，考察三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷是否具有保護作用，并初步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 三七多糖由本實驗室分離、純化;MDA、GSH-Px 和SOD 檢測試劑盒購自南京建成生物研究所;TNF-α、IL-1β 及IL-10 檢測試劑盒購自美國R＆D 公司;其余試劑為國產分析純。

1.2 模型建立、分組及給藥 雄性Wistar 大鼠，體重250～300 g，購自吉林大學實驗動物中心，適應性飼養(yǎng)1 w 后，隨機分成5 組，假手術組、模型組、尼莫地平組［10 mg/(kg·d)］、三七多糖高劑量組［300 mg/(kg·d)］、三七多糖低劑量組［100 mg/(kg·d)］，每組10 只。尼莫地平及三七多糖組連續(xù)灌胃給藥15 d，每天1 次。假手術組和模型組則灌胃給予等體積生理鹽水。采用Longa 改良方法［5］，應用頸內動脈線栓法建立大鼠腦缺血再灌注模型。

1.3 腦組織含水量檢測 缺血2 h 再灌注24 h 后，斷頭處死大鼠，取腦。稱取腦組織濕重后，置105℃烘箱至恒重，再秤干重。用下列公示計算腦組織含水量:

腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%

1.4 腦梗死面積檢測 缺血2 h 再灌注24 h后，斷頭處死大鼠，取腦。經連續(xù)2 mm 冠狀切片及TTC(2%)溶液染色，用多聚甲醛(4%)固定。不能被TTC 染色的白色區(qū)域為梗死區(qū)，應用美國NIH 公司的ImageJ 1.41 圖像分析軟件計算梗死面積大小。

1.5 腦組織MDA、GSH-Px、SOD、TNF-α、IL-1β和IL-10 測定 于再灌注后24 h 將各組大鼠處死，取缺血再灌注側大腦，用濾紙吸去殘血，準確稱重。在冰水浴條件按下，加入4 ℃生理鹽水上(1∶ 9)，勻漿后，離心(4000 r/min，10 min)，分裝上清液于冰箱中保存?zhèn)溆谩７謩e采用化學比色法測定腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性，采用ELISA 測定TNF-α、IL-1β 和IL-10 含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理，所得結果以()表示，與模型組比較，P ＜0.05或P ＜0.01認為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 三七多糖對大鼠腦組織含水量及腦梗死面積比的影響 如表1 所示，假手術組大鼠腦組織含水量顯著低于模型組(P ＜0.01)，而尼莫地平和三七多糖高、低劑量組均可以明顯降低大鼠腦缺血再灌注后腦組織含水量(P ＜0.05 or P ＜0.01);同時，大鼠腦缺血再灌注后有明顯的腦梗死發(fā)生，而尼莫地平及三七多糖高、低劑量組均可以顯著降低腦組織梗死面積比(P ＜0.05)。

表1 三七多糖對大鼠腦組織含水量及腦梗死面積比的影響(，n=10)

表1 三七多糖對大鼠腦組織含水量及腦梗死面積比的影響(，n=10)

與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

2.2 三七多糖對大鼠腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性的影響 如表2 所示，與模型組比較，假手術組大鼠腦組織MDA 含量低于腦缺血再灌注模型組，而GSH-Px 和SOD 活性高于模型組(P ＜0.01)。與模型組比較，尼莫地平組及高、低劑量三七多糖組均能使缺血再灌注損傷大鼠腦組織MDA 含量降低，GSH-Px、SOD 活性升高(P ＜0.01)，且存在一定的劑量關系。

表2 三七多糖對大鼠腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性的影響(，n=10)

表2 三七多糖對大鼠腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性的影響(，n=10)

與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

2.3 三七多糖對大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 和IL-10 含量的影響 如圖1 所示，與模型組比較，假手術組大鼠腦組織TNF-α 和IL-1β 含量明顯降低，而IL-10 含量明顯升高(P ＜0.01)。與模型組比較，尼莫地平組及高、低劑量三七多糖組均能使缺血再灌注損傷大鼠腦組織TNF-α 和IL-1β 含量降低，升高IL-10 含量(P ＜0.01)，且存在一定的劑量關系。

3 討論

腦血管疾病是危害人類健康最重要的疾病之一，而缺血性腦血管疾病占全部腦血管疾病的60%～80%，具有發(fā)病率高、復發(fā)率高和致殘率高的特點。治療腦缺血性損傷應盡早恢復血液再灌注，而研究發(fā)現(xiàn)，缺血后的血流恢復在特定情況下可導致組織損傷和功能障礙，即缺血再灌注損傷［6］。因此，預防和治療腦缺血再灌注損傷已成為防治缺血性腦血管疾病的重要環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，三七多糖預處理可以顯著減少腦缺血再灌注大鼠模型腦組織含水量及腦梗死面積(P ＜0.05 or P ＜0.01)，表明三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

圖1 三七多糖對大鼠腦組織TNF-α(A)和IL-1β(B)、IL-10(C)含量的影響(，n=10)

氧化應激是導致腦缺血再灌注后組織損傷的重要因素之一，特別是氧自由基理論在其中占有重要地位，MDA、GSH-Px 和SOD 與氧自由基密切相關［7］。MDA 為脂質過氧化產物，可以反應機體受氧化應激損害的程度［8］;GSH-Px 能夠催化過氧化氫使其分解成氧化型GSH 和水，從而減少體內過氧化氫的含量，起到保護機體免受氧化損傷的作用［9］;而SOD 是機體內清除氧自由基最重要的酶，廣泛存在于各種生物體內，能清除氧自由基保護機體免受氧化損傷［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，高、低劑量的三七多糖均能使缺血再灌注損傷大鼠腦組織的MDA 含量降低，SOD 活性和GSH-Px 含量升高(P ＜0.01)。此結果表明，三七多糖具有一定的抗氧化作用，可以改善缺血再灌注大鼠腦組織氧化應激水平，三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用的機制可能與其提高腦組織抗氧化能力有關。

氧化應激可以導致促炎癥反應細胞因子增加，從而使炎性細胞因子產生，這是腦缺血再灌注損傷炎癥機制的核心調控因素之一［11］。在腦缺血再灌注損傷中，與炎癥反應相關的因子主要有TNF-α 和IL 等。其中TNF-α 在腦缺血后誘發(fā)的組織損傷和白細胞浸潤中起重要作用，可使多核白細胞聚集并釋放炎癥介質，阻斷TNF-α 的表達是減少缺血性神經元損傷的有效措施［12］;IL-1β 能夠協(xié)同其他細胞因子促進B、T 細胞活化，并且能夠誘導包括TNF-α在內的炎性因子的產生［13］;IL-10 是一種細胞免疫反應抑制劑，可以抑制IL-1 和TNF-α 等細胞因子生成，從而具有保護神經細胞的作用［14］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，高、低劑量的三七多糖均能夠降低缺血再灌注損傷大鼠腦組織IL-1β 和TNF-α 含量，提高IL-10 含量(P ＜0.01)。此結果表明，三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與抑制炎癥因子的產生有關?？傊ㄟ^以上研究結果表明，三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，該保護作用與其提高腦組織抗氧化能力、抑制炎癥因子的過度產生有關。

［1］楊志剛，陳阿琴，俞頌東.三七藥理研究新進展［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2005，39(4):59-62.

［2］鮑建才，劉 剛，叢登立，等.三七的化學成分研究進展［J］.中成藥，2006，28(2):246-253.

［3］陳新霞，顧呈華，楊明晶，等.三七多糖對小鼠免疫功能調節(jié)的研究［J］.江蘇預防醫(yī)學，2007，18(3):10-11.

［4］姜曼花，胡劍卓，邱文高，等.白背三七多糖和黃酮降血糖及耐缺氧作用［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2009，29(13):1074-1076.

［5］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［6］Jian LK，Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases and free radicals in cerebral ischemia［J］.Free Radic Biol Med，2005，39:71-80.

［7］Wang TF，Lei Z，Li YX，et al.Oxysophoridine protects against focal cerebral ischemic injury by inhibiting oxidative stress and apoptosis in mice［J］.Neurochem Res，2013，38(11):2408-2417.

［8］Pirinccioglu AG，G?kalp D，Pirinccioglu M，et al.Malondialdehyde(MDA)and protein carbonyl(PCO)levels as biomarkers of oxidative stress in subjects with familial hypercholesterolemia［J］.Clin Biochem，2010，43(15):1220-1224.

［9］Djordjevic A，Spasic S，Jovanovic-Galovic A，et al.Oxidative stress in diabetic pregnancy:SOD，CAT and GSH-Px activity and lipid peroxidation products［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2004，16(6):367-372.

［10］Reddi AR，Jensen LT，Naranuntarat A，et al.The overlapping roles of manganese and Cu/Zn SOD in oxidative stress protection［J］.Free Radic Biol Med，2009，46(2):154-162.

［11］Hou SZ，Li Y，Zhu XL，et al.Ameliorative effects of diammonium glycyrrhizinate on inflammation in focal cerebral ischemic-reperfusion injury［J］.Brain Res，2012，1447:20-27.

［12］Benveniste EN.Inflammatory cytokines within the central nervous system:sources，function，and mechanism of action［J］.Am J Physiol，1992，263:1-16.

［13］Castellanos M，Castillo J，Garcia MM，et al.Inflammation-mediated damage in progressing lacunar infarctions:a potential therapeutic target［J］.Stroke，2002，33:982-987.

［14］Cyktor JC，Turner J.Interleukin-10 and immunity against prokaryotic and eukaryotic intracellular pathogens［J］.Infect Immun，2011，79:2964-2973.