吉西他濱的體內(nèi)外抗肝癌作用研究

孫家躍，左 靖，金義光（.宿州市立醫(yī)院藥劑科，安徽宿州 34000；.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所藥物化學研究室，北京 00850）

肝臟是人體內(nèi)最大的器官，在消化、儲存能量及生物轉(zhuǎn)化解毒等方面扮演重要的角色。肝癌分為原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌。我國的肝癌多屬于原發(fā)性肝癌，病死率高，在惡性腫瘤死亡中位居第3 位，僅次于胃癌、食管癌。原發(fā)性肝癌的治療主要包括手術(shù)治療、化療、放療及各種方式綜合治療等[1]，以手術(shù)切除療法為主、同時運用各種手段進行綜合治療是目前肝癌治療的主要方案[2-3]。但20世紀90年代至今，肝癌患者相對5年生存率一直在10%以下，主要是因為肝癌的高復發(fā)率和有效治療藥物的缺乏[4]，因此有效、相對安全的化療藥物的選擇一直是研究熱點。

吉西他濱是核苷類抗癌藥，具有高緩解率、可延長生存期和低副反應等優(yōu)勢，能明顯提高患者的生活質(zhì)量，有效延長患者的生命，且在門診使用符合藥物經(jīng)濟學原則。臨床上常應用于非小細胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌等癌癥[5-7]，也有一些報道吉西他濱聯(lián)合其他抗腫瘤藥物治療肝癌[8-9]。本文將進一步研究吉西他濱對肝癌細胞的體內(nèi)外抑制作用，為吉西他濱對肝癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BS110S 型電子天平（德國Sartorius 公司）；Heal Force?力康純水儀（上海康雷分析儀器有限公司）；GL-88B型旋渦混合器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）；TGL-16B 型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

吉西他濱原料藥（北京凱萊森醫(yī)藥科技有限公司，批號：20110203，純度：99.6%）；DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO，分析純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；MTT 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 細胞株

人乳腺癌MCF-7 細胞株購自北京化工大學細胞庫；人肝癌HepG2 細胞株購自北京師范大學細胞庫；小鼠肝癌H22 細胞株由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所提供。

1.4 動物

SPF級昆明小鼠，♂，體質(zhì)量25～30 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2012-0001。該動物實驗通過軍事醫(yī)學科學院動物倫理委員會同意。

2 方法

2.1 吉西他濱對HepG2和MCF-7細胞的抑制作用

將HepG2 和MCF-7 細胞分別用DMEM 培養(yǎng)液稀釋至1×104個/ml，接種于兩塊96 孔 板中，200 μl/孔。于5% CO2和37 Ⅵ飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加不同濃度的吉西他濱使其終濃度分別為5、10、20、30、50、70、90 μmol/L。分別作用24、48、72 h后，除去培養(yǎng)液，每孔加20 μl MTT，4 h后加150 μl DMSO 溶解。于酶標儀450 nm 波長處測定各孔的光密度（OD），計算細胞抑制率，抑制率（%）＝[（不加藥孔OD值－加藥孔OD 值）/加藥孔OD 值]×100%[10]。采用SPSS 軟件Probit回歸分析計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.2 吉西他濱對小鼠肝腫瘤的抑制作用

將H22細胞株復蘇稀釋后于無菌條件下接種在小鼠腹腔內(nèi)增殖7 d，從瘤株生長較好的小鼠腹腔抽取H22細胞液，生理鹽水稀釋至2×1010個/L，取0.2 ml 皮下接種于小鼠右前腋下，10 d 后，手觸有硬塊即為瘤接種成功。挑取10 只荷瘤大小均勻的小鼠隨機分為對照組（生理鹽水）與吉西他濱組（40 mg/kg），每組5 只，每隔2 d 尾iv 藥物1 次，共給藥3 次[11]。觀察小鼠毛發(fā)和精神狀態(tài)，記錄每天體質(zhì)量變化。末次給藥后第2天處死小鼠，摘取實體瘤，稱瘤濕質(zhì)量，計算吉西他濱的抑瘤率。抑瘤率（%）＝（對照組平均瘤濕質(zhì)量－吉西他濱組平均瘤濕質(zhì)量）/對照組平均瘤濕質(zhì)量×100%。

2.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行One-way ANOVA分析，檢驗標準α＝0.05，比較各組間差異。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 吉西他濱對MCF-7和HepG2細胞的抑制作用

作用24 h 時，吉西他濱對MCF-7 的IC50為30 μmol/L，對HepG2 的IC50＞90 μmol/L；而作用48、72 h 時，吉西他濱對MCF-7 和HepG2 的IC50均＜5 μmol/L。吉西他濱作用24 h 時對MCF-7 細胞的抑制率均大于對HepG2 細胞的抑制率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。吉西他濱對MCF-7 細胞和HepG2細胞的抑制作用見圖1。

圖1 吉西他濱對MCF-7細胞和HepG2細胞的抑制作用A.24 h；B.48 h；C.72 hFig 1 Inhibitory effect of gemcitabine on MCF-7 cells and HepG2 cellsA.24 h；B.48 h；C.72 h

3.2 吉西他濱對荷瘤小鼠精神狀態(tài)和體質(zhì)量的影響

實驗過程中，對照組荷瘤小鼠逐日消瘦，運動量減少，精神不振，毛發(fā)暗沉；而吉西他濱組荷瘤小鼠食欲正常，毛發(fā)有光澤，較活躍。對照組荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的增加消除了消瘦帶來的體質(zhì)量減少，導致其與吉西他濱組荷瘤小鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義，因此小鼠體質(zhì)量對實驗結(jié)果無影響。兩組荷瘤小鼠的體質(zhì)量測定結(jié)果見圖2。

3.3 吉西他濱對荷瘤小鼠的抗腫瘤作用

對照組荷瘤小鼠的實體瘤濕質(zhì)量分別為4.4、3.3、4.3、4.5、5.3 g，平均質(zhì)量為（4.36±0.64）g；吉西他濱組荷瘤小鼠的實體瘤濕質(zhì)量分別為1.9、0.9、0.9、1.1、0.8 g，平均質(zhì)量為（1.12±0.41）g，吉西他濱對荷瘤小鼠的抑制率為75.76%。

圖2 兩組荷瘤小鼠的體質(zhì)量測定結(jié)果Fig 2 Body weight of tumor-bearing mice in 2 groups

4 討論

吉西他濱是一線抗腫瘤藥物，對癌細胞有較強的殺滅作用。但目前其臨床應用大多局限于對其特殊敏感的癌細胞，如乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌等，在肝癌的治療上卻應用較少。本研究結(jié)果顯示，≥30 μmol/L的吉西他濱體外作用72 h，對人肝癌細胞的抑制作用與其對人乳腺癌細胞的抑制作用相當；動物實驗也初步表明，吉西他濱對小鼠H22實體瘤有較好的抑制作用。筆者認為臨床上未將吉西他濱作為肝癌治療首選藥的主要原因可能是吉西他濱的肝組織分布不夠高，在肝周圍不易達到較高的治療濃度，且較低的肝靶向性易引起較嚴重的副作用。筆者建議將吉西他濱與靶向材料相結(jié)合制成靶向肝組織的抗肝癌藥物，應會有較廣闊的臨床應用前景。

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