N-三甲基殼聚糖包覆的水飛薊賓脂質(zhì)體的制備及處方工藝優(yōu)化

何 文，胡翠蘋(píng)，瞿 振（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 40060；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 40064；.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 40064）

水飛薊賓（SLB）是從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取所得的一種黃酮化合物，具有明顯的保護(hù)和穩(wěn)定肝細(xì)胞、改善肝功能的作用[1]。其藥理作用包括抗肝纖維化、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和降血脂等[2]，被廣泛應(yīng)用于治療各種肝功能紊亂疾病，如肝硬化、肝炎、脂肪肝等[3]。SLB是一種脂溶性的物質(zhì)，口服生物利用度低[4]，嚴(yán)重影響了其藥效的發(fā)揮。脂質(zhì)體作為一類(lèi)新型藥物載體，能實(shí)現(xiàn)靶向和緩釋給藥，提高難溶性藥物的生物利用度，降低藥物毒副作用。N-三甲基殼聚糖（TMC）是殼聚糖的水溶性衍生物，帶正電，因其良好的組織相容性和生物可降解性，被廣泛用作納米粒的載體材料[5]；同時(shí)，帶正電荷的高分子載體藥物進(jìn)入體內(nèi)后，可很快被體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，易于聚集在肝臟[6]。為了提高SLB 的肝靶向性，本研究擬采用季銨化程度約為60%的TMC（簡(jiǎn)稱(chēng)TMC60）包覆SLB 脂質(zhì)體（SLBL），形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體（TMC60-SLBL），并對(duì)其處方及制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為SLB肝靶向制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

SPD-20A、LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Zetasizer 3000HS 型激光粒度分析儀（英國(guó)馬爾文公司）；H-1600RW型高速冷凍離心機(jī)（武漢世紀(jì)超杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

SLB 原料藥（西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：FD20140117，純度：98%）；SLB 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110856-201305，純度：≥98%）；TMC60（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20130530，季銨化程度：64.4%）；卵磷脂（批號(hào)：20130724）和膽固醇（批號(hào)：20120627）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇為色譜純，氯仿、乙醇等試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 SLB的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[7]色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（54∶46∶0.5），流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：288 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。分別取適量SLB對(duì)照品、TMC60-SLBL、空白TMC60 脂質(zhì)體樣品，經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，在此條件下，輔料對(duì)SLB測(cè)定無(wú)干擾。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密稱(chēng)取在真空干燥箱60 ℃干燥至恒質(zhì)量的SLB對(duì)照品10 mg，置于50 ml量瓶中，加適量甲醇溶解，并用流動(dòng)相定容，搖勻，制備成200 μg/ml的貯備液。分別精密量取貯備液0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 ml，置于10 ml量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，稀釋得到質(zhì)量濃度為2、5、10、20、40、80 μg/ml 的對(duì)照品溶液。用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后，進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為y＝69 379x+21 315（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，SLB 檢測(cè)質(zhì)量濃度的線(xiàn)性范圍為2～80 μg/ml。

2.1.3 回收率試驗(yàn) 取空白TMC60脂質(zhì)體2 ml，置于10 ml量瓶中，精密吸取不同量的SLB貯備液，制備成5、20、60 μg/ml的樣品，再用適量甲醇破乳，并加流動(dòng)相定容搖勻，以離心半徑2.5 cm（下同）、12 000 r/min 離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，平均回收率分別為（99.33±1.00）%、（99.85±0.92）%、（100.00±0.56）%，RSD分別為1.01%、0.92%、0.56%（n＝3）。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取不同量的SLB 貯備液于10 ml量瓶中，用流動(dòng)相定容并制備成5、20、60 μg/ml 的溶液，于同日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5 次，連續(xù)測(cè)定5 d，考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD 分別為1.22%、0.97%、0.96%（n＝5），日間RSD分別為1.63%、1.18%、0.80%（n＝5）。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批TMC60-SLBL樣品6份，測(cè)定并計(jì)算SLB含量。結(jié)果，含量的RSD為0.42%（n＝6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.2 SLBL制備方法的選擇

2.2.1 薄膜分散法 稱(chēng)取卵磷脂20 mg、膽固醇2 mg、SLB 1 mg 于500 ml 茄形瓶中，加入15 ml 氯仿與乙醇的混合溶劑充分溶解；于45 ℃水浴減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，形成均勻透明的薄膜，繼續(xù)抽真空除去殘余溶劑；加入10 ml 生理鹽水水合介質(zhì)洗膜，于45 ℃恒溫水浴水化1 h，得到乳狀半透明脂質(zhì)體溶液，并高速剪切分散10 min，密封置于4 ℃冰箱保存。

2.2.2 復(fù)乳法 稱(chēng)取卵磷脂20 mg、膽固醇2 mg、SLB 1 mg 于500 ml梨形瓶中，加入一定體積有機(jī)溶劑（體積比為2∶1的三氯甲烷-乙醇）溶解，再加入少量生理鹽水，100 W 超聲乳化5 min，形成乳白色的W/O 型乳液；再于45 ℃水浴減壓蒸餾，除去少量有機(jī)溶劑，加入10 ml生理鹽水，形成W/O/W型復(fù)乳；溫度保持不變，壓力不變，繼續(xù)蒸餾除盡有機(jī)溶劑，形成乳白色懸浮液狀的脂質(zhì)體，并高速剪切分散10 min，置于4 ℃冰箱保存。

2.2.3 逆向蒸發(fā)法 稱(chēng)取卵磷脂20 mg、膽固醇2 mg、SLB 1 mg于500 ml梨形瓶中，加入一定體積有機(jī)溶劑（體積比為2∶1的三氯甲烷-乙醇）溶解，再加10 ml生理鹽水超聲5 min，減壓蒸餾，直至形成反膠束凝膠；維持真空，繼續(xù)減壓蒸餾至其塌陷形成乳白色懸浮液狀的脂質(zhì)體，并高速剪切分散10 min，置于4 ℃冰箱保存。

2.3 包封率的測(cè)定[8]

取SLBL 混懸液1 ml，加甲醇超聲破乳，3 500 r/min 離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣分析，測(cè)定SLB總含量Wz。另取SLBL混懸液1 ml，以1 000 r/min離心10 min，除去SLB 結(jié)晶，取上層脂質(zhì)體溶液，于4 ℃下12 000 r/min 離心60 min，收集下層脂質(zhì)體，用甲醇破乳，離心除去沉淀，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣測(cè)定，得到包載的SLB含量Wb。計(jì)算包封率：包封率＝Wb/Wz×100%。“2.2”項(xiàng)下3 種方法制備的SLBL的包封率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 包封率測(cè)定結(jié)果（，n＝3，%）Tab 1 Result of encapsulation efficiency（，n＝3，%）

表1 包封率測(cè)定結(jié)果（，n＝3，%）Tab 1 Result of encapsulation efficiency（，n＝3，%）

注：與剪切前比較，＊P＜0.05Note：vs.before cutting，＊P＜0.05

經(jīng)SPSS 21 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，薄膜分散法制備的脂質(zhì)體的包封率在剪切前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明薄膜分散法剪切前后的包封率無(wú)明顯改變；而復(fù)乳法和逆向蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體的包封率在剪切前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即高速剪切對(duì)此兩種方法制備的脂質(zhì)體的包封率影響較大?？梢?jiàn)薄膜分散法制備的SLBL包封率較高，調(diào)整粒徑后對(duì)包封率的影響也較小。因此，最終選擇薄膜分散法制備SLBL。

2.4 TMC60-SLBL的制備

稱(chēng)取卵磷脂、膽固醇、SLB 適量，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備SLBL初懸液；然后取處方量的TMC60（按與脂材的體積比為1∶4 的量）于40 ml 純水中溶解，將10 ml 脂質(zhì)體初懸液，以1 ml/min 的速度恒速滴加到上述TMC60 溶液中，攪拌速度為300 r/min；待脂質(zhì)體完全滴加完畢后，再繼續(xù)攪拌10 min，即得混懸狀包衣脂質(zhì)體；經(jīng)高速剪切分散10 min，即得TMC60-SLBL。

2.5 單因素對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響

按照文獻(xiàn)[8]，以脂質(zhì)體包封率為主要考察指標(biāo)，考察磷脂質(zhì)量濃度、磷脂-膽固醇質(zhì)量比、藥脂質(zhì)量比、水合溫度、水合時(shí)間、TMC60的質(zhì)量濃度對(duì)包封率的影響。結(jié)果表明，包封率隨著磷脂質(zhì)量濃度的增加而增大，可能是由于單位體積脂質(zhì)材料的增加，形成的脂質(zhì)體數(shù)量也增多，包封藥物的量也隨之增加。膽固醇能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性和影響膜的通透性，在一定范圍內(nèi)，包封率隨著膽固醇比例的增大而增大，當(dāng)膽固醇量過(guò)高時(shí)，包封率減小[9]。有研究認(rèn)為，一定條件下，脂質(zhì)體膜對(duì)藥物的包封有一個(gè)相對(duì)飽和值，因此在低于飽和值時(shí)，包封率隨藥脂質(zhì)量比的增大而增大，超過(guò)飽和值時(shí)則相反[10]。水合溫度對(duì)包封率的影響也較大，溫度過(guò)低，磷脂分子的流動(dòng)性差，不利于藥物的包封；溫度過(guò)高，易引起磷脂的氧化，導(dǎo)致包封率減小。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，水合時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，磷脂會(huì)被氧化成深黃色而使脂質(zhì)體不穩(wěn)定，短時(shí)間內(nèi)沉淀，同時(shí)結(jié)合包封率的結(jié)果，確定水合時(shí)間為1 h。TMC60的質(zhì)量濃度對(duì)包封率無(wú)明顯影響（P＞0.05）。因此，選擇對(duì)包封率影響較大的磷脂質(zhì)量濃度、磷脂-膽固醇質(zhì)量比、藥脂質(zhì)量比、水合溫度4 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化脂質(zhì)體處方工藝

以磷脂質(zhì)量濃度（A）、磷脂-膽固醇質(zhì)量比（B）、藥脂質(zhì)量比（C）、水合溫度（D）為因素，以包封率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化處方工藝。因素與水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗(yàn)安排與結(jié)果Tab 3 Design and result of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Analysis result of variance

由表3 和表4 可知，各因素對(duì)包封率影響大小順序?yàn)镃＞D＞B＞A；經(jīng)方差分析，B、C、D 對(duì)包封率有明顯影響（P＜0.05）。綜合考慮，最優(yōu)處方工藝組合為A2B3C2D2，即磷脂質(zhì)量濃度為6 mg/ml，磷脂-膽固醇質(zhì)量比為40∶1，藥脂質(zhì)量比為1∶30，水合溫度為45 ℃。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最優(yōu)處方工藝制備3 批TMC60-SLBL，測(cè)定包封率。結(jié)果，包封率分別為82.23%、84.62%、79.39%，平均包封率為（82.08±2.6）%，RSD為3.17%（n＝3），說(shuō)明本處方工藝所制樣品包封率較高，方法重復(fù)性較好。

2.8 滲漏率考察[11]

取按照最優(yōu)處方工藝制備的TMC60-SLBL 適量，放入密封好的西林瓶中，置于4 ℃和25 ℃的條件下貯存，于1、7、15、30 d 后取樣1 ml，分別以1 000 r/min 離心10 min，收集下層SLB 結(jié)晶。取上層脂質(zhì)體溶液，于4 ℃下12 000 r/min 離心60 min，收集上層游離SLB，合并兩次收集的SLB后進(jìn)樣分析，得到游離藥物的量，按公式計(jì)算：Q＝（m1－m2）/m3×100%，其中Q為滲漏率，m1為貯存放置一段時(shí)間后測(cè)得的游離藥物的量，m2為貯存前測(cè)得的游離藥物的量，m3為貯存前包封的藥量。TMC60-SLBL在4、25 ℃下的滲漏率-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 TMC60-SLBL在4、25 ℃下的滲漏率-時(shí)間曲線(xiàn)（n＝3）Fig 1 Permeability-time curves of TMC60-SLBL at 4 and 25 ℃（n＝3）

由圖1 可知，脂質(zhì)體的滲漏率與保存溫度密切相關(guān)，TMC60-SLBL在4 ℃貯存的穩(wěn)定性較在25 ℃好。

2.9 粒徑及Zeta電位

取按照最優(yōu)處方工藝制備的TMC60-SLBL 及未包覆TMC60 的SLBL 適量，分別置于樣品池中，分散均勻，采用激光粒度儀測(cè)定平均粒徑和和Zeta 電位。結(jié)果，TMC60-SLBL和SLBL 的平均粒徑分別為（161.2±2.0）、（131.9±1.9）nm，Zeta電位分別為（36.73±2.84）、（－23.18±1.14）mV（n＝3）。

3 討論

3.1 樣品含量的計(jì)算

SLB以一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體的形式存在[7]，在高效液相色譜分析中表現(xiàn)為雙峰，2010 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定含量測(cè)定以?xún)煞迕娣e之和進(jìn)行定量。

3.2 流動(dòng)相比例的確定

參照《中國(guó)藥典》和文獻(xiàn)[7]，最終將流動(dòng)相調(diào)整為甲醇-水-冰醋酸（54∶46∶0.5）。調(diào)整過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，加大冰醋酸的比例可以抑制峰形拖尾，可能是因?yàn)镾LB 的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有較多的羥基，可以與色譜柱中的硅羥基（吸電子基團(tuán)）產(chǎn)生作用力。酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，使得硅羥基呈分子狀態(tài)，從而不易吸引SLB中的羥基氫。

3.3 制備方法的確定

本試驗(yàn)前期采用了薄膜分散法、復(fù)乳法、逆向蒸發(fā)法、乙醇注入法等方法來(lái)制備SLBL。但在制備的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)使用的磷脂和膽固醇微溶于乙醇，雖然通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)有少量脂質(zhì)體形成，但是不穩(wěn)定，幾個(gè)小時(shí)后就出現(xiàn)了沉淀，于是舍棄了乙醇注入法。前3種方法都能制備成較穩(wěn)定的脂質(zhì)體，通過(guò)高速剪切機(jī)分散，包封率都出現(xiàn)不同程度的降低，可能是因?yàn)楦咚偌羟羞^(guò)程中產(chǎn)生的能量高，導(dǎo)致脂質(zhì)體氧化，藥物發(fā)生滲漏；薄膜分散法制備的多為大多層脂質(zhì)體（MLV）[12]，而MLV脂質(zhì)體層數(shù)多，受到高速剪切破壞的程度較小，因此包封率下降程度相對(duì)較小，這與文獻(xiàn)[12]的結(jié)果類(lèi)似。除此之外，在使用前3種方法制備脂質(zhì)體的過(guò)程中均使用了有機(jī)溶劑，而薄膜分散法可以盡可能迅速且完全地除去有機(jī)溶劑。有害有機(jī)溶劑的限度檢查擬在后續(xù)研究作補(bǔ)充。

3.4 處方工藝優(yōu)化

本文通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出TMC60-SLBL 的最優(yōu)處方，制得產(chǎn)品包封率高、重現(xiàn)性好；與未包覆的SLBL相比，TMC60-SLBL的Zeta 電位由負(fù)變正，具有較高的正電性。有研究表明，Zeta電位的絕對(duì)值越大（大于15 mV），粒子間的靜電斥力越大，越穩(wěn)定[13]。本實(shí)驗(yàn)中TMC60-SLBL的Zeta電位為（36.73±2.84）mV、粒徑較小，表明穩(wěn)定性良好，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

[1]Basiglio CL，Sánchez Pozzi EJ，Mottino AD，et al.Differential effects of silymarin and its active component silibinin on plasma membrane stability and hepatocellular lysis[J].Chem Biol Interact，2009，179（2/3）：297.

[2]劉志剛，李雪玲，翁立冬，等.水飛薊素藥理作用研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（10）：91.

[3]Burczynski FJ，Wang GQ，Nguyen D，et al.Silymarin and hepatoprotection[J].J Cent South Univ：Med Sci，2012，37（1）：6.

[4]El-Samaligy MS，Afifi NN，Mahmoud EA.Increasing bioavailability of silymarin using a buccal liposomal delivery system：preparation and experimental design investigation[J].Int J Pharm，2006，308（1/2）：140.

[5]廖德華，羅新，向大雄.以N-三甲基殼聚糖為載體的納米粒研究進(jìn)展[J].世界臨床藥物，2012，33（9）：554.

[6]郝愛(ài)軍，張寧，郭興家，等.EPR作用及其在抗腫瘤大分子藥物研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)新藥雜志，2012，21（21）：2 516.

[7]岑菁，許瑞祥，夏培元，等.RP-HPLC 法測(cè)定水飛薊賓原料藥的含量和有關(guān)物質(zhì)[J].中國(guó)藥房，2014，25（17）：1 614.

[8]Kumar N，Rai A，Reddy ND，et al.Silymarin liposomes improves oral bioavailability of silybin besides targeting hepatocytes，and immune cells[J].Pharmacol Rep，2014，66（5）：788.

[9]陳博.維A酸脂質(zhì)體的制備工藝研究[J].中國(guó)藥房，2014，25（21）：1 973.

[10]姚新武，劉長(zhǎng)霞，張鵬.響應(yīng)面法優(yōu)化龍膽苦苷脂質(zhì)體的復(fù)乳法制備工藝[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，39（2）：68.

[11]李學(xué)濤，程嵐，賈天柱.異長(zhǎng)春花堿脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)研究[J].中藥材，2011，34（1）：119.

[12]郜海濤，顧黎，張鵬英，等.牛蒡寡糖脂質(zhì)體的制備和性質(zhì)鑒定[J].科技通報(bào)，2010，26（6）：863.

[13]喻樊，楊錦明.β-谷甾醇替代膽固醇制備槲皮素脂質(zhì)體的可行性研究[J].中草藥，2013，44（23）：3 303.