紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆(Scophthalmus maximus)的非特異性免疫功能的影響*

秦志華 董文賓 姜令緒 王仁杰 張啟迪單 虎 ① 雷霽霖

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 青島 266109; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是中國(guó)北方沿海地區(qū)的重要海水養(yǎng)殖品種, 但是隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展, 特別是集約化、規(guī)模化程度的不斷提高, 給魚(yú)類疾病防治提出了新的挑戰(zhàn)。在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中由于抗生素等藥物的不正當(dāng)使用, 不僅使病原微生物產(chǎn)生抗藥性, 耐藥菌株不斷增加, 水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能下降, 同時(shí)也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 如“多寶魚(yú)藥殘事件”使整個(gè)大菱鲆產(chǎn)業(yè)受到了沉重打擊。因此,如何提高大菱鲆的健康養(yǎng)殖水平, 促進(jìn)大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展, 成為當(dāng)前的首要任務(wù)。

中草藥作為免疫增強(qiáng)劑符合發(fā)展無(wú)公害漁業(yè)、生產(chǎn)綠色水產(chǎn)品的需求。國(guó)內(nèi)外很多研究證明, 中草藥免疫增強(qiáng)劑可顯著增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的抗病能力。國(guó)外學(xué)者以單方中草藥牛膝和旱蓮草分別投喂露斯塔野鰻和羅非魚(yú), 結(jié)果表明能顯著提高機(jī)體的免疫力(Rao et al, 2005; Christybapita et al, 2007)。國(guó)內(nèi)學(xué)者用復(fù)方中草藥投喂羅非魚(yú)(張照紅等, 2011)、牙鲆(李霞等,2011)、草魚(yú)(李超等, 2011)等, 均能有效地提高機(jī)體非特異性免疫力。在我國(guó), 紫錐菊作為非傳統(tǒng)中草藥,近幾年的研究越來(lái)越多, 但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究較少。僅有任永林(2008)關(guān)于紫錐菊對(duì)鯉魚(yú)的生產(chǎn)性能和免疫功能的影響研究。

大菱鲆是近年來(lái)推廣的養(yǎng)殖品種, 有關(guān)紫錐菊對(duì)它的作用效果尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)給大菱鲆注射不同濃度的紫錐菊提取物, 測(cè)定其非特異性免疫指標(biāo)以及機(jī)體的抗病力, 研究其對(duì)大菱鲆的免疫效果, 進(jìn)而為其在大菱鲆養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)藥物紫錐菊提取物(有效成分為5.4%菊苣酸)由青島市康地恩藥業(yè)有限公司提供。試驗(yàn)用魚(yú)購(gòu)買于膠南通用水產(chǎn)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用魚(yú)分為 4個(gè)組, 對(duì)照組(注射生理鹽水),低劑量組(10mg/mL)、中劑量組(20mg/mL)、高劑量組(40mg/mL), 每組10尾魚(yú), 每組設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)大菱鲆體重 250±20g, 以重復(fù)為單位飼養(yǎng)于水循環(huán)室內(nèi), 保持水溫在 14—15 °C之間。鹽度為31—33, pH為7.8—8.3, 24h不間斷充氧, 馴化及試驗(yàn)期間足量投喂基礎(chǔ)飼料, 定時(shí)除去殘餌。進(jìn)行為期7d馴化, 再進(jìn)行28d試驗(yàn)。

每天上午10點(diǎn)對(duì)大菱鲆注射不同濃度的紫錐菊0.2mL, 觀察大菱鲆的攝食量、精神活動(dòng)狀態(tài)并記錄。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品采集 在試驗(yàn)過(guò)程中的7、14、21、28d分別對(duì)各組大菱鲆取樣(n=12), 取樣前 1h停止注射紫錐菊提取物。分別用無(wú)菌采血器從大菱鲆尾靜脈中抽血, 每尾采血樣1.0mL, 其中10尾的血液置于離心管中, 通過(guò)凍融法破碎細(xì)胞, 在3000r/min, 離心15 min,取血清進(jìn)行溶菌酶活力和超氧化物歧化酶活力的測(cè)定。

在注射試驗(yàn)的第28天對(duì)各組大菱鲆取樣(n=10),取樣前1h停止注射紫錐菊提取物。分別從尾靜脈中采血, 每尾采血樣 1.0mL, 進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng), 測(cè)定呼吸爆發(fā)活力。

1.4.2 溶菌酶活力測(cè)定 根據(jù)王雷等(1994)的方法略做修改, 用0.067mo1/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.4)將溶壁微球菌配制成 0.2mg/mL的菌懸液, 每個(gè)樣品取 3mL菌懸液, 加入 40μL血清, 混勻后立即在540nm下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值 A, 然后在 28°C水浴中放置 30min, 立即取出轉(zhuǎn)入 4°C冰浴以中止反應(yīng),再在540nm下測(cè)定B值。按公式計(jì)算溶菌酶的活力U= (B–A)/B 。

1.4.3 吞噬細(xì)胞吞噬活力的測(cè)定 參照劉紅等(2006)的方法, 在0.5mL抗凝血中加入0.2mL遲緩愛(ài)德華氏菌(含菌量 1×108CFU/mL), 置于 25°C 培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)1h, 3000r/min離心15min, 取沉淀底層物抹片, 甲醇固定 5—10min, 瑞氏染色 30s, 姬母薩氏染色10 min, 蒸餾水沖洗, 吹干。在油鏡下觀察100個(gè)吞噬細(xì)胞的吞噬情況, 計(jì)數(shù)并計(jì)算吞噬細(xì)胞的吞噬百分比(PP)。

1.4.4 超氧化物歧化酶活性的測(cè)定 SOD活力的測(cè)定采用連苯三酚自氧化法(鄧碧玉等, 1991), 以每毫升反應(yīng)液中, 每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量定義為一個(gè)活力單位。

1.4.5 大菱鲆原代細(xì)胞的培養(yǎng) 在大菱鲆肌肉注射紫錐菊提取物溶液后的第4周取樣。取樣之前魚(yú)禁食 24h。從每個(gè)處理隨機(jī)選取6尾魚(yú), 重?fù)趑~(yú)的頭部使其昏迷, 解剖分離頭腎, 迅速轉(zhuǎn)移到 L-15 培養(yǎng)基中(含有1%雙抗和2%血清) 。在無(wú)菌條件下, 用100目篩絹將頭腎組織研磨成細(xì)胞懸液, 用51%的percoll溶液在 2200r/min下進(jìn)行離心 30min, 以分離巨噬細(xì)胞, 并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)細(xì)胞存活數(shù), 將細(xì)胞濃度調(diào)整至 107個(gè)/mL。在 96孔板的每孔加入 100μL 調(diào)好濃度的頭腎巨噬細(xì)胞于18°C下培養(yǎng)2h (Ortu?o et al, 2000)。

1.4.6 呼吸爆發(fā)活力的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)方法參考Dolmatova(2004)的方法并略作改動(dòng)。在96孔板培養(yǎng)的貼壁巨噬細(xì)胞懸液去掉上清液后, 在每孔中加入100μL的1mg/mL氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液(NBT), 18°C下孵育2h。棄去上清液, 再加入200μL 100%的甲醇固定巨噬細(xì)胞, 室溫反應(yīng)10min后, 再用70%的甲醇溶液洗 2次, 然后將 96孔板自然風(fēng)干。風(fēng)干后在每孔中加入120mL 2mol/L的 KOH和140μL的二甲基亞砜(DMSO)。用振蕩器緩慢振蕩5min后, 室溫下在620nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.5 攻毒試驗(yàn)

注射試驗(yàn)28d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn), 攻毒試驗(yàn)每組10尾魚(yú), 共4組。試驗(yàn)用遲緩愛(ài)德華氏菌由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所提供, 預(yù)試驗(yàn)確定攻毒濃度為1 × 108CFU/mL, 每尾注射0.2mL, 連續(xù)觀察7d,統(tǒng)計(jì)每組的死亡率, 計(jì)算免疫保護(hù)率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,進(jìn)行Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌肉注射紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

如圖 1所示, 注射 7、15、21、28d紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響極顯著(P＜0.01), 高劑量組與中劑量組差異不顯著(P＞0.05),與其它兩個(gè)劑量組差異極顯著(P＜0.01), 低劑量組與空白對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響Fig.1 Effects of E. purpurea extract on superoxide dismutase(SOD) activity of turbot

2.2 肌肉注射紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆溶菌酶(LSZ)活力的影響

如圖 2所示, 注射 7、15、21、28d后紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆溶菌酶活力的影響極顯著(P＜0.01), 高劑量組與中劑量組差異不顯著(P＞0.05), 而與其它兩個(gè)劑量組差異極顯著(P＜0.01), 低劑量組與空白對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆溶菌酶活力的影響Fig.2 Effects of E. purpurea extract on turbot lysozyme activity

2.3 肌肉注射紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力的影響

圖3所示, 注射28d后紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力的影響極顯著(P＜0.01), 高劑量組與空白組差異極顯著(P＜0.01), 而與其它兩個(gè)劑量組差異不顯著(P＞0.05), 低劑量組和中劑量組與空白對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 注射紫錐菊提取物28d對(duì)大菱鲆吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力的影響Fig.3 Effects of injection of E. purpurea extract 28d on turbot phagocytic respiratory burst activity

2.4 肌肉注射紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆吞噬細(xì)胞吞噬率(PP)的影響

圖 4所示, 注射 15d、28d后紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆吞噬細(xì)胞的吞噬活力的影響顯著(0.01＜P＜0.05),高劑量組與其它 3個(gè)試驗(yàn)組差異顯著(0.01＜P＜0.05),低劑量組和中劑量組與空白對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖4 紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆吞噬細(xì)胞吞噬率的影響Fig.4 Effects of E. purpurea extract on phagocyte phagocytosis rate of turbot

2.5 攻毒試驗(yàn)

從表 1中看出肌肉注射射紫錐菊提取物能顯著提高大菱鲆的免疫保護(hù)率, 其中高劑量組與中劑量組差異不顯著(P＞0.05)。高劑量組、中劑量組與低劑量組、空白對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

3.1 紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆溶菌酶和吞噬細(xì)胞吞噬活力的影響

魚(yú)類由于其特異性免疫機(jī)制尚不完善, 非特異性免疫在其防御體系中具有重要作用。其中溶菌酶和吞噬細(xì)胞在魚(yú)類抵抗各種病原微生物中發(fā)揮重要作用。溶菌酶是存在于溶酶體內(nèi)的水解酶, 是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)和重要的非特異性免疫因子, 能使吞噬細(xì)胞的吞噬活性增強(qiáng)(Amar et al,2004; 孟小亮等, 2009)。因此, 通過(guò)測(cè)定魚(yú)類血液中吞噬細(xì)胞吞噬能力以及血清中的溶菌酶活性, 可以從一定程度上衡量魚(yú)類非特異性免疫力(劉勇等,2007)。徐歆(2014)研究表明, 紫錐菊提取物能夠能夠通過(guò)增強(qiáng)小鼠機(jī)體的抗體分泌和非特異性免疫,來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能, 并且能夠提高小鼠抗沙門氏菌感染的能力。紀(jì)簡(jiǎn)常等(2002)研究表明, 中草藥能顯著提高建鯉的溶菌酶活力。本研究表明, 紫錐菊提取物能顯著的提高大菱鲆溶菌酶活力, 整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程, 高劑量組與中劑量組對(duì)溶菌酶活力提升比較顯著, 低劑量組對(duì)溶菌酶活力的影響不顯著,而高劑量紫錐菊提取物對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬活力影響比較顯著, 其它劑量組不是很顯著, 綜上所述, 紫錐菊提取物能有效的提高大菱鲆的非特異免疫因子的活力。

表1 攻毒后的死亡率和免疫保護(hù)率Tab.1 The survival rate and relative percent survival rate after challenged by E. tarda

3.2 紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)抗氧化酶系的重要酶類, 對(duì)生物體內(nèi)活性氧自由基的清除起著至關(guān)重要的作用, 檢測(cè)抗氧化指標(biāo)可以反映機(jī)體的抗氧化能力和免疫情況。研究表明, 紫錐菊提取物對(duì)能顯著的提高大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力, 注射到第7天時(shí), 高劑量組與中劑量組對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活力提升比較顯著, 低劑量組沒(méi)有顯著變化,隨著試驗(yàn)的進(jìn)行, 注射 15、21、28d, 高劑量組對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響弱于中劑量組, 但是差異不是很顯著。說(shuō)明紫錐菊提取物在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大菱鲆的超氧化物歧化酶(SOD)活力維持在一個(gè)比較高的水平。陳孝煊等(2003)用 1%金銀花的飼料喂養(yǎng)異育銀鯽, 血清中 SOD的活性增強(qiáng), 這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果類似。

3.3 肌肉注射紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力的影響

吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力功能在宿主防御及炎癥反應(yīng)中起著重要的作用, 在吞噬過(guò)程或受刺激產(chǎn)生呼吸爆發(fā), 消耗氧氣釋放大量活性氧自由基(邢宇坤等, 2004)。呼吸爆發(fā)增強(qiáng)后能增加氧化水平以此來(lái)刺激吞噬細(xì)胞, 在魚(yú)類非特異性免疫中被認(rèn)為是一個(gè)重要的指標(biāo)(Miyazaki, 1998), 注射28d后測(cè)試表明高劑量組顯著的提高大菱鲆吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力,而其它劑量組沒(méi)有顯著變化。說(shuō)明隨著紫錐菊提取物濃度的提高, 對(duì)大菱鲆吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力也有所增強(qiáng)。

3.4 攻毒試驗(yàn)

攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示, 高劑量組對(duì)大菱鲆的免疫保護(hù)率最高, 中劑量組次之, 低劑量組較差, 結(jié)合對(duì)大菱鲆的非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定, 基本符合試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果。說(shuō)明紫錐菊提取物能顯著的提高大菱鲆非特異性免疫力及機(jī)體抗病力。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆非特異性免疫力的影響。結(jié)果表明, 紫錐菊提取物可提高大菱鲆魚(yú)體非特異性免疫功能, 增強(qiáng)抗病力。因此, 將紫錐菊提取物應(yīng)用為大菱鲆免疫刺激劑具有廣闊的前景。但是, 紫錐菊提高魚(yú)體免疫力的機(jī)理還不甚清楚,不同濃度紫錐菊提取物對(duì)大菱鲆免疫力的影響也有待于進(jìn)一步研究。

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