長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)兩個(gè)Dmrt家族基因的時(shí)空表達(dá)*

張 娜 黃 雯 許 飛 李 莉 張國(guó)范 郭希明

(1. 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;3. Haskin Shellfish Research Laboratory, Institute of Marine and Coastal Sciences, Rutgers University, Port Norris, New Jersey USA 08349)

Dmrt (Doublesex and mab-3 related transcription factor)是近年來(lái)比較受關(guān)注的一個(gè)基因家族, 因?yàn)檫@個(gè)家族中的一些基因在無(wú)脊椎和脊椎動(dòng)物中都與性別決定和兩性分化相關(guān)。DM 結(jié)構(gòu)域最先在果蠅(Drosophila melanogaster)的性別調(diào)控基因Doublesex中發(fā)現(xiàn)的(Burtis et al, 1989), 隨后又在很多物種, 如魚(yú)類(Guan et al, 2000; Marchand et al, 2000; Kondo et al, 2002; Nanda et al, 2002; Koopman et al, 2003;Ohmuro-Matsuyama et al, 2003)、鳥(niǎo)類(Raymond et al,1999; Smith et al, 1999; Ren et al, 2001)、爬行類(Raymond et al, 1999; Smith et al, 1999; Kettlewell et al, 2000)和哺乳類(Raymond et al, 1998; Raymond et al, 1999; Smith et al, 1999; De Grandi et al, 2000;Moniot et al, 2000; Kim et al, 2003)的同源基因中都發(fā)現(xiàn)了它的存在, 說(shuō)明該家族的基因在無(wú)脊椎和脊椎動(dòng)物中都是高度保守的。長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)中共編碼 3個(gè)含有 DM 結(jié)構(gòu)域的基因, 分別是Cg-DM1(CGI_10015952), CgDsx(CGI_10019568)以及CgDmrtA2 (CGI_10001830) (Zhang et al, 2014)。編號(hào)為CGI_10015952的基因最初被Naimi等(2009)認(rèn)定為 Cg-DMl, 并認(rèn)為該基因具有與性腺發(fā)育相關(guān)的作用。CGI_10019568基因含有典型的 DM 結(jié)構(gòu)域, 而且與果蠅的Doublesex (Dsx)基因同源關(guān)系很近, 因此被命名為CgDsx (Zhang et al, 2014)。果蠅的Dsx基因與線蟲(chóng)的Mab-3以及脊椎動(dòng)物的Dmrt1基因都對(duì)雄性的性別決定起著關(guān)鍵的作用。果蠅的Dsx基因可通過(guò)可變剪切在卵巢和精巢中分別產(chǎn)生雌性和雄性兩種剪切形式(Burtis et al, 1989)。線蟲(chóng)的Mab-3與脊椎動(dòng)物的 Dmrt1基因都在雄性性腺中特異表達(dá)并促進(jìn)雄性特征的發(fā)育(Smith et al, 2009; Kopp, 2012)。

CGI_10001830除了含有Dmrt家族共有的DM保守結(jié)構(gòu)域外, 還含有 Dmrt家族的亞族(subfamily)DmrtA的DMA結(jié)構(gòu)域, 而且其與 DmrtA2(Dmrt5)同源性很高, 因此將其命名為 CgDmrtA2 (Zhang et al,2014)。DmrtA家族成員包括Dmrta1(Dmrt4), Dmrta2(Dmrt5), Dmrta3(Dmrt3) (Volffet al, 2003)。在小鼠中,Dmrt4在各組織中都有表達(dá)(Balciunieneet al, 2006)。牙鲆(Paralichthys olivaceus)的 Dmrt4在精巢中表達(dá)量很高, 在卵巢中幾乎沒(méi)有表達(dá), 另外在腦部和鰓中的表達(dá)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它組織, 因而牙鲆的Dmrt4在性腺, 神經(jīng)以及感覺(jué)器官的發(fā)育過(guò)程中可能起到重要作用(Wen et al, 2009)。而該基因在青鳉中的表達(dá)模式卻很特殊, 只在耳板和苦膽中表達(dá)(Winkler et al,2004)。在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育時(shí)期, Dmrt5在原腸胚后期表達(dá)量很高, 并主要表達(dá)于胚胎時(shí)期的中樞神經(jīng)系統(tǒng), 特別是中腦及中后腦的神經(jīng)系統(tǒng), 而且其在斑馬魚(yú)的雌雄性腺的生殖細(xì)胞中均有表達(dá)(Guoet al,2004)。在斑馬魚(yú)體節(jié)發(fā)生過(guò)程中, Dmrt5只在端腦,中腦和嗅板中表達(dá), 其對(duì)后部-背部端腦細(xì)胞的分化起著重要的作用(Yoshizawa et al, 2011)。Dmrt5在非洲爪蟾蜍胚胎發(fā)育過(guò)程中, 對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生具有重要的調(diào)節(jié)作用(Parlier et al, 2013)。另外, Dmrt5對(duì)小鼠胚胎早期大腦的皮層及腹側(cè)中腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育都是不可或缺的(Kim et al, 2003; Gennet et al,2011; Konno et al, 2012; Saulnier et al, 2013)。在斑馬魚(yú)中, Dmrta3即Dmrt3對(duì)于嗅板、神經(jīng)管和生殖細(xì)胞的發(fā)育都具有潛在的影響(Li et al, 2008)。在小鼠和雞中, Dmrt3只在胚胎中表達(dá), 其中在小鼠胚胎的前腦,神經(jīng)管和鼻腔結(jié)構(gòu)中表達(dá), 在雞胚胎早期形成的體節(jié),體節(jié)前中胚層以及勒氏管中表達(dá)(Smith et al, 2002)。

Cg-DM1(CGI_10015952)基因已被詳細(xì)報(bào)道過(guò)(Naimiet al, 2009)。Zhang等(2014)通過(guò)對(duì)基因組和轉(zhuǎn)錄組的分析發(fā)現(xiàn)CgDmrtA2可能和性別決定無(wú)關(guān), 而CgDsx可能和性別決定有關(guān)。鑒于Zhang等的結(jié)果是基于有限的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 因此作者進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析對(duì)Zhang等的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果加以印證, 對(duì)長(zhǎng)牡蠣的CgDsx以及CgDmrtA兩個(gè)基因進(jìn)一步分析, 研究這兩個(gè)基因在長(zhǎng)牡蠣的雌雄個(gè)體、組織間的表達(dá)特征以及在幼蟲(chóng)各發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式, 以確定這兩者在長(zhǎng)牡蠣性別決定中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用成體長(zhǎng)牡蠣于2013年5月取自青島市嶗東養(yǎng)殖場(chǎng), 為處于成熟期的二齡牡蠣, 用顯微鏡檢驗(yàn)雌雄后分別取三只雌性和三只雄性的外套膜、鰓、閉殼肌和性腺組織樣品用于RNA提取。幼蟲(chóng)樣品也取自青島嶗東海珍品良種培育有限公司, 發(fā)育時(shí)期通過(guò)顯微鏡觀察確定后, 在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)取樣。樣品取出后立刻用液氮冷凍, 隨后轉(zhuǎn)移到–80°C冰箱保存。

1.2 總RNA的提取及cDNA模板的合成

將取得的樣品用液氮充分研磨之后取 100mg左右的干粉將之加入Trizol Reagent (Invitrogen)中并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總 RAN的提取。提取到的總 RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA的完整性, 用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)檢測(cè)純度與濃度。cDNA的合成使用PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa)試劑盒, 根據(jù)使用說(shuō)明, 每20μL反應(yīng)體系加入1μg的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 得到的cDNA用于下一步的熒光定量PCR反應(yīng)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)所涉及的引物序列詳見(jiàn)表 1。引物使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì), 送上海生工(Sangon)生物技術(shù)有限公司合成。引物稀釋成10μmol/mL的濃度備用。

表1 實(shí)驗(yàn)涉及引物名稱、序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.1 Primer name, sequence, and product length used in this study

1.4 序列比對(duì)

CgDsx以及 CgDmrtA2的蛋白序列可從 http://oysterdb.cn/上獲得, 并在NCBI上搜索相關(guān)的同源蛋白序列, 用于蛋白序列比對(duì)分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)已知的CgDsx以及CgDmrtA2序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì), 幼蟲(chóng)時(shí)期的內(nèi)參基因使用 Ribosomal protein S18 (RS18), 成體時(shí)期的內(nèi)參基因使用(Eukaryotic translation elongation factor 2 (EF2))。采用相對(duì)定量的方法對(duì)長(zhǎng)牡蠣這兩個(gè) DM 家族基因在成體各組織及幼蟲(chóng)各時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)采用ABI7500 Fast熒光定量PCR儀, SYBR Green I 熒光染料。反應(yīng)體系如下:

反應(yīng)條件: 95°C 30s, 一個(gè)循環(huán); 95°C 5s, 60°C 30s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù), 另外再做3個(gè)無(wú)模板的陰性對(duì)照。通過(guò)ABI 7500 V2.0.2軟件輸出反應(yīng)的Ct值, 采用2–ΔΔCt法對(duì)這兩個(gè)基因在不同組織和不同幼蟲(chóng)時(shí)期的表達(dá)差異進(jìn)行相對(duì)定量研究。

表2 幼蟲(chóng)分期明細(xì)Tab.2 Details of larval stages

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)牡蠣CgDsx與CgDmrtA2基因的同源比較與進(jìn)化分析

2.1.1 CgDsx的同源比較與進(jìn)化分析 CgDsx的序列分析及同源關(guān)系比對(duì)已經(jīng)在Zhang等(2014)的文章中詳細(xì)闡述過(guò), 這里僅展示其與其它物種同源基因的蛋白序列比對(duì)結(jié)果(圖1)。從圖1中可以看出, 長(zhǎng)牡蠣的 CgDsx氨基酸序列與其它物種的同源性不高,DM家族的成員之間除了共有的一個(gè)DM結(jié)構(gòu)域之外,其它序列的保守性很低(Kopp, 2012)。

2.1.2 CgDmrtA2的同源比較與進(jìn)化分析 長(zhǎng)牡蠣的CgDmrtA2的ORF長(zhǎng)1173bp, 編碼390個(gè)氨基酸,含有2個(gè)外顯子。該基因除了含有典型的DM結(jié)構(gòu)域外, 還含有一個(gè)DmrtA家族特有的DMA結(jié)構(gòu)域。而且該基因與 Dmrta2/Dmrt5親緣關(guān)系較近, 因此被命名為DmrtA2 (Zhang et al, 2014)。CgDmrtA2與小鼠的Dmrta2(Dmrt5)同源性達(dá)到79% (e-value 5e-31), 與人類的同源性為77% (e-value 2e-31), 與斑馬魚(yú)的同源性為36% (e-value 2e-46), 與東方紅鰭豚的同源性為37% (e-value 3e-44)。目前沒(méi)有軟體動(dòng)物 Dmrta2/Dmrt5方面的報(bào)道, 也沒(méi)有相關(guān)的數(shù)據(jù)可供比對(duì), 目前數(shù)據(jù)顯示, 牡蠣 CgDmrtA2與哺乳動(dòng)物的 Dmrta2(Dmrt5)同源性更高。

2.2 長(zhǎng)牡蠣CgDsx和CgDmrtA2基因的時(shí)空表達(dá)分析

2.2.1 長(zhǎng)牡蠣CgDsx和CgDmrtA2基因在幼蟲(chóng)時(shí)期的表達(dá)分析 實(shí)驗(yàn)測(cè)定了包括卵子在內(nèi), 直至稚貝的27個(gè)時(shí)期(見(jiàn)表2)的表達(dá)模式。CgDsx在卵子到D型幼蟲(chóng)中后期的表達(dá)量較高, D型幼蟲(chóng)后期到稚貝期表達(dá)量開(kāi)始降低, 卵子到 D型幼蟲(chóng)中后期的表達(dá)量平均值是其后表達(dá)量平均值的4.15倍。CgDmrtA2在卵子和二細(xì)胞期的表達(dá)量都很低, 到桑椹期開(kāi)始增高, 到D4期的時(shí)候達(dá)到最高, 隨之稍有下降, 到U11期又達(dá)到一個(gè)較高的水平, 到U30期降到低點(diǎn), 之后未有明顯升高。

圖1 長(zhǎng)牡蠣和其它物種Doublesex同源基因的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Alignment of Doublesex homolog amino acid sequences of C. gigas and other species

圖2 長(zhǎng)牡蠣和其它物種Dmrta2/Dmrt5基因的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of Dmrta2/Dmrt5 homolog amino acids sequences of C. gigas and other species

2.2.2 長(zhǎng)牡蠣CgDsx和CgDmrtA2基因在不同組織中的表達(dá)分析 實(shí)驗(yàn)所用成體牡蠣均為二齡成熟期個(gè)體, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, CgDsx基因在雄性性腺中的表達(dá)量顯著(P＜0.01)高于其它組織, 雄性性腺的表達(dá)量是雌性性腺的8.9倍。在除性腺之外的體細(xì)胞組織中,CgDsx表達(dá)量低, 彼此間無(wú)太大差異。CgDmrtA2基因在各組織中均有表達(dá), 在雄性性腺中表達(dá)量最低,在雌性性腺中最高, 雌性性腺的表達(dá)量是雄性性腺的5倍, 在另外3個(gè)組織中差異也不明顯。

3 討論

Dmrt家族基因的共有特征就是一個(gè)含有鋅指結(jié)構(gòu)可與特異DNA序列結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域-DM結(jié)構(gòu)域(Dmrt8除外(Veith et al, 2006))。該家族基因在許多種類, 包括節(jié)肢動(dòng)物, 線蟲(chóng)類以及脊椎動(dòng)物中都參與調(diào)控性別的分化與發(fā)育, 因而該基因家族可能是首例廣泛分布的性別調(diào)控基因。在線蟲(chóng)C. elegans中, 含有DM結(jié)構(gòu)域的Mab-3基對(duì)于雄性的發(fā)育是必需的,它與果蠅中的 Doublesex基因發(fā)揮類似的作用(Shen et al, 1988; Yi et al, 1999)。在脊椎動(dòng)物中, Dmrt1基因展示出在早期的雄性性腺中特異表達(dá)的模式(Zarkower, 2001, 2002)。含有Dmrt1基因的區(qū)域被報(bào)道與人類男性的性逆轉(zhuǎn)相關(guān)(Bennett et al, 1993;Crocker et al, 1988; Flejter et al, 1998; Guioli et al,1998; Veitia et al, 1997, 1998), 而且Dmrt1基因還是小鼠出生后精巢發(fā)育所必需的(Raymond et al, 2000)。珊瑚蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)一種含有DM結(jié)構(gòu)域的基因, 它同樣表現(xiàn)出具有與性別決定和分化相關(guān)的功能(Miller et al, 2003)。

長(zhǎng)牡蠣基因組中共發(fā)現(xiàn) 3個(gè)含有 DM結(jié)構(gòu)域的Dmrt家族基因, 分別是 Cg-DM1 (CGI_10015952),CgDsx (CGI_10019568)以及CgDmrtA2 (CGI_10001830)(Naimi et al, 2009; Zhang et al, 2014)。而在線蟲(chóng)、果蠅和人類中的該家族基因的數(shù)目分別是 11個(gè)、4個(gè)和7個(gè)(Matson et al, 2012)。Cg-DM1(CGI_10015952)曾被報(bào)道過(guò)(Naimi et al, 2009)。CgDsx (CGI_10019568)與果蠅的 doublesex、線蟲(chóng)的Mab-3以及脊椎動(dòng)物的Dmrt1是同源基因。CgDsx雖然含有3個(gè)外顯子, 但沒(méi)有表現(xiàn)出雌雄相關(guān)的可變剪切(Zhang et al, 2014)。定量 PCR結(jié)果表明它在雄性性腺中表達(dá)量最高,這和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致, 它很可能在長(zhǎng)牡蠣的性別決定中起關(guān)鍵作用或促進(jìn)雄性發(fā)育。其在雌性性腺中也稍有表達(dá), 雄性性腺的表達(dá)量是雌性性腺的 8.9倍,這或許意味著雌性性腺中存在著休眠的精子, 隨時(shí)為性別轉(zhuǎn)變做著準(zhǔn)備。牡蠣的性腺中同時(shí)存在著兩種生殖細(xì)胞, 這或許是性別轉(zhuǎn)變的先決條件(Cole, 1941;Guo et al, 1998; Zhang et al, 2014)。

圖3 Real-time qPCR檢測(cè)CgDsx和CgDmrtA2在幼蟲(chóng)時(shí)期的表達(dá)模式Fig.3 Expression profiles of CgDsx and CgDmrtA2 in larval stages幼蟲(chóng)分期詳見(jiàn)表2

圖4 CgDsx和CgDmrtA2在不同成體組織中的表達(dá)模式Fig.4 Expression profiles of CgDsx and CgDmrtA2 in different adult tissues

通過(guò) DM 結(jié)構(gòu)域的同源比對(duì)及進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),CgDsx與果蠅的doublesex聚到一起。CgDsx與無(wú)脊椎動(dòng)物的同源基因進(jìn)化距離較近, 與脊椎動(dòng)物的Dmrt1進(jìn)化距離較遠(yuǎn)(Zhang et al, 2014)。CgDsx在囊胚期到擔(dān)輪幼蟲(chóng)初期表達(dá)量較高, 說(shuō)明在該段時(shí)期的發(fā)育需要CgDsx的參與。

Cg01830(CGI_10001830)是 Dmrt家族的亞族DmrtA中的一員。通過(guò)同源比對(duì)及進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),Cg01830與Dmrta2/Dmrt5同源關(guān)系較近(Zhang et al,2014)。據(jù)報(bào)道, Dmrt5對(duì)大腦以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育具有重要的作用(Kim et al, 2003; Guo et al, 2004;Gennetet al, 2011; Yoshizawa et al, 2011; Konno et al,2012; Parlier et al, 2013; Saulnier et al, 2013)。在長(zhǎng)牡蠣中, 該基因在卵子和二細(xì)胞期的表達(dá)量很低, 到桑椹期開(kāi)始增高, 到 U22期一直保持較高的表達(dá)量,U30期降到低點(diǎn), 之后未有明顯升高。這說(shuō)明,CgDmrtA2主要在長(zhǎng)牡蠣的D形到U22期幼蟲(chóng)階段合成, 在這期間發(fā)揮的作用可能也與其在斑馬魚(yú)及小鼠的胚胎中行使的功能類似, 與神經(jīng)系統(tǒng)的形成相關(guān)。在成體中, 該基因在所有組織中均有表達(dá), 雌性性腺中表達(dá)量最高, 其次是鰓和外套膜, 在雄性性腺中表達(dá)量最低, 但各組織間表達(dá)差異都不顯著。因此該基因應(yīng)不參與長(zhǎng)牡蠣的性別決定和分化等功能,其具體功能還需要進(jìn)一步探索與研究。

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