HOXC6通過激活轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活性

曹曉瑋，閻錫新，劉姣姣，楊　濤(.河北省石家莊市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 石家莊 0500；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 石家莊 050000；.河北省石家莊市第一醫(yī)院普外科，河北 石家莊0500)

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·論著·

HOXC6通過激活轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活性

曹曉瑋1，閻錫新2*，劉姣姣1，楊濤3(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 石家莊 050000；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院普外科，河北 石家莊050011)

[摘要]目的通過轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，探討同源異型盒C6(homeobox C6,HOXC6)在腫瘤進(jìn)展中的作用機(jī)制。方法應(yīng)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、transwell、免疫熒光及Western blot檢測腫瘤細(xì)胞中HOXC6表達(dá)對轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路及腫瘤細(xì)胞活性的影響。結(jié)果過表達(dá)HOXC6的肝癌細(xì)胞Huh-7細(xì)胞遷移數(shù)明顯高于未轉(zhuǎn)染HOXC6組(P<0.01)，磷酸化Smad2表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)染HOXC6組(P<0.01)，而Smad2/3表達(dá)明顯少于未轉(zhuǎn)染HOXC6組(P<0.01)。過表達(dá)HOXC6的肝癌細(xì)胞Huh-7 Smad2在細(xì)胞核中表達(dá)強(qiáng)。結(jié)論HOXC6過表達(dá)可激活TGF-β信號通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活性。

[關(guān)鍵詞]腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)的；基因,同源異型盒；轉(zhuǎn)化生長因子β

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.015

惡性腫瘤是目前威脅人類生命健康的主要疾病，其中肺癌、肝癌等惡性腫瘤又是世界上主要的致死癌癥[1-2]。惡性腫瘤目前沒有有效的藥物治療，特別是肺癌、肝癌又易早期轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者不能接受手術(shù)治療，包括根治性切除。此外，由于腫瘤的高復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性，致使手術(shù)療效依然不佳。因此，了解疾病的分子學(xué)基礎(chǔ)是惡性腫瘤預(yù)防和治療非?？扇〉男虏呗浴Ｄ壳耙延醒芯孔C實，同源異型盒基因(homeobox,HOX)是一個含有至少200個轉(zhuǎn)錄因子的家族，含有一個高度保守的由61個氨基酸同源結(jié)構(gòu)域纏繞而成的DNA。人類HOX家族由39個成員組成，共分為A、B、C、D 4類，存在于7、17、12、2號染色體上，“形似性”用于描述不同種群中基因的關(guān)系，以證明在染色體中存在最大的相同序列也就是相同的基因排列(如HOXA5、HOXB5、HOXC5)。而有13個形似性群體存在，不是說HOX基因簇存在于所有13組里，而是每組包含2～4名成員。HOX家族是發(fā)育調(diào)控基因，其在組織發(fā)育和分化過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，在組織復(fù)制中起關(guān)鍵作用。在多種癌癥包括肺癌、白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌[3-9]中發(fā)現(xiàn)HOX基因失調(diào)。HOX家族成員HOXC6在肺癌、卵巢癌、食管癌、乳腺癌和前列腺癌中異常表達(dá)，HOXC6表達(dá)水平也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[10-12]。同時有研究表明，胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌患者HOXC6過表達(dá)術(shù)后有效生存期明顯縮短，并證實HOXC6可作為胃癌及食管鱗狀細(xì)胞癌術(shù)后效果評估的指標(biāo)[13]。HOXC6通過調(diào)節(jié)其生物學(xué)目標(biāo)起作用，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein-7,BMP7)、成纖維細(xì)胞生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2,FGER2)、血小板源性生長因子受體α多肽(platelet derived growth factor receptor,PEGFRA)。它也調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號通路。以往研究表明，HOXC6 siRNA敲除誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，HOXC6過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增生和凋亡減少。本研究通過干擾肝癌細(xì)胞中HOXC6的表達(dá)觀察其對腫瘤細(xì)胞活性的影響，并揭示HOXC6在腫瘤細(xì)胞中的作用途徑，旨在為深入研究腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制提供研究線索，并為臨床腫瘤治療提供一個潛在的靶點?，F(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料人肝癌細(xì)胞株Huh-7、HepG2購自美國模式菌種收集中心。達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco minimum essential medium,DMEM)和胎牛血清購自美國Invitrogen公司，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚購自美國Invitrogen公司、兔多克隆抗體HOXC6(1∶1 000)購自英國Abcam公司，磷酸化蛋白Smad2(1∶1 000)和Smad2/3(1∶1 000)購自美國Cell signaling公司，紅外線標(biāo)記的兔抗人二抗購自德國LI-COR公司，Odyssey雙色紅外熒光成像儀購自德國LI-COR公司。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2肝癌細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株Huh-7、HepG2從液氮罐中取出，置于恒溫水浴箱中(37 ℃)，使凍存細(xì)胞懸液溶解后加入37 ℃溫育的培養(yǎng)基DMEM中。1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，常規(guī)置于DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素)，37 ℃,5% CO2加濕空氣培養(yǎng)。

1.3質(zhì)粒構(gòu)建利用HepG2細(xì)胞株的總DNA 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)得到全長的HOXC6 cDNA。引物序列為：正向5′-GGATCCATGAATTCCTACT-TCACT-3′；反向5′-CTCGAGTCACTCTTTCTG-CTTCT-3′。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物克隆到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點上。建立HOXC6 siRNAs表達(dá)載體。用熒光標(biāo)記梯度濃度的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞株Huh-7，轉(zhuǎn)染后于37 ℃ 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在800 mg/L G418溶液中篩選HOXC6過表達(dá)的Huh-7細(xì)胞系。

1.4免疫熒光實驗將細(xì)胞置于含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液玻璃皿中培養(yǎng)30 min。在室溫下以0.1%的Triton X-100滲透化細(xì)胞30 min并以0.5%牛血清白蛋白封堵30 min。用磷酸鹽緩沖液沖洗后，和一抗于4 ℃培養(yǎng)過夜。再次用磷酸鹽緩沖液洗滌，在室溫下和用共軛異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗培養(yǎng)1 h，然后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色。以O(shè)LYMPUS顯微鏡成像，拍攝照片。

1.5Western blot檢測每個樣本加入30 μg裂解液，用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，隨后培養(yǎng)于兔多克隆抗體HOXC6(1∶1 000)，Smad2(1∶1 000)、Smad2/3(1∶1 000)，4 ℃過夜。二抗孵育：以Tris緩沖液(Tris-buffered saline and tween 20，TBST)洗膜，10 min×3次，然后加入1∶10 000稀釋的紅外線標(biāo)記的兔抗人二抗，37 ℃孵育1.5～2.0 h。成像：采用德國LI-COR公司Odyssey雙色紅外熒光成像儀成像，分析條帶的OD，計算目的產(chǎn)物條帶OD/β-actin產(chǎn)物條帶OD，作為目的產(chǎn)物的相對含量。

1.6Transwell實驗用Transwell實驗檢測肝癌細(xì)胞的侵襲能力。Matrigel-coated transwell 小室上室中以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1×105細(xì)胞，下室則含完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后，黏附到膜表層的細(xì)胞以棉簽清除，遷移到底部的細(xì)胞以70%甲醇固定并用結(jié)晶紫染色。對遷移到膜底部的細(xì)胞進(jìn)行倒置顯微鏡拍攝照片和計數(shù)。

2結(jié)果

2.1HOXC6過表達(dá)能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力將HOXC6低表達(dá)的肝癌細(xì)胞系Huh-7 轉(zhuǎn)染HOXC6，然后應(yīng)用Transwell實驗檢測肝癌細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示過表達(dá)HOXC6肝癌細(xì)胞Huh-7細(xì)胞遷移數(shù)明顯高于未轉(zhuǎn)染HOXC6組(P<0.01)，見表 1。

表1　肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOXC6后侵襲能力的變化 　，個)

2.2HOXC6能夠通過激活TGF-β信號通路增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力應(yīng)用Western blot檢測TGF-β信號通路中關(guān)鍵蛋白Smad2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOXC6肝癌細(xì)胞Huh-7中磷酸化Smad2表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)染HOXC6組(P<0.01)，而Smad2/3表達(dá)明顯少于未轉(zhuǎn)染HOXC6組(P<0.01)，見表2。

應(yīng)用免疫熒光實驗檢測肝癌細(xì)胞Huh-7轉(zhuǎn)染HOXC6后Smad2在細(xì)胞內(nèi)定位的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOXC6的肝癌細(xì)胞Huh-7與未轉(zhuǎn)染HOXC6的肝癌細(xì)胞Huh-7 相比Smad2在細(xì)胞核中表達(dá)強(qiáng) (圖1)。

表2　肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOXC6后Smad2及

圖1肝癌細(xì)胞Huh-7轉(zhuǎn)染HOXC6后Smad2在細(xì)胞內(nèi)定位的變化(免疫熒光 ×100)

3討論

很多分子途徑通過控制胚胎發(fā)育過程參與腫瘤形成。HOX轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育中必不可少，且在細(xì)胞關(guān)鍵的分化和增殖中起決定性作用。已有報道稱在畸形和惡性腫瘤中HOX基因表達(dá)異常，故HOX基因的表達(dá)在惡性腫瘤診斷和治療中可能很重要[14]。無論在體內(nèi)還是體外，HOX過表達(dá)都能使哺乳動物的細(xì)胞改變，且在許多腫瘤類型中都發(fā)現(xiàn)了HOX基因的表達(dá)。正常HOX基因的表達(dá)被破壞，通過多種途徑促進(jìn)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。

不同種類HOX基因失調(diào)與人類數(shù)種癌癥相關(guān)，包括肺癌、肝癌、白血病、大腸癌、乳腺癌、腎癌、黑色素瘤和皮膚鱗狀細(xì)胞癌等[3-8]。因為各個基因并不一致，所以考慮HOX不是一個單一的致病基因，而是組織特異性干擾已有的HOX導(dǎo)致其表達(dá)失調(diào)來致病。在人體內(nèi)，HOX基因構(gòu)成數(shù)個最大的基因家族，包含一個序列，稱為同源異型盒。同源異型盒首先在果蠅的同源基因中確定。HOX基因是高度保守的，它跨越的范圍很廣，從秀麗隱桿線蟲、果蠅到人類。1992年，建立了脊椎動物的統(tǒng)一命名系統(tǒng)，按規(guī)定人類基因用大寫字母(HOXA1)，小鼠基因用小寫字母(Hoxa1)。小鼠基因破壞的研究表明，在發(fā)育過程中基因有一定程度的功能性合作，這些研究正在擴(kuò)展到人體組織。然而，由于旁系關(guān)系復(fù)雜，個人HOX基因的重要性目前未知。事實上，越來越多證據(jù)表明，同樣的HOX基因在不同組織中功能不同，這種蛋白結(jié)構(gòu)的特異性很重要。

HOXC6是HOX家族成員，據(jù)猜測它的功能可能是通過位于其N端的DNA同源結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合到DNA的啟動子元件上。HOXC6在肺癌、卵巢癌、食管癌、乳腺癌和前列腺癌中異常表達(dá)，HOXC6表達(dá)水平也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在前列腺細(xì)胞中，HOXC6直接調(diào)節(jié) BMP7、FGFR2、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3和PDGFRA的表達(dá)，間接影響糖蛋白Wnt信號通路；抑制PDGFRA可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，而它的過表達(dá)能夠?qū)筆DGFRA抑制的影響[9]。HOXC6過表達(dá)可導(dǎo)致胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后有效生存期明顯縮短，HOXC6可作為胃癌及食管鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后效果評估的指標(biāo)。HOXC6表達(dá)增加有促進(jìn)癌癥淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的傾向，HOXC6 siRNA敲除誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，HOXC6過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增生和凋亡減少。提示HOXC6可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。

TGF-β是一種以二硫鍵鏈接的多肽，在其結(jié)構(gòu)中有9個半胱氨酸殘基通過二硫鍵鏈接組成半胱氨酸的剛性結(jié)構(gòu)，目前已發(fā)現(xiàn)TGF-β在哺乳動物中存在TGF-β1、TGF-β2、 TGF-β3共3個亞單位，它們的核苷酸序列具有高度的同源性。其中TGF-β1位于人類第19號染色體上，是一種多效性細(xì)胞因子，有助于切口愈合、血管生成、纖維化等。越來越多證據(jù)表明，TGF-β1既可以作為腫瘤抑制因子，又能通過SMAD蛋白依賴和非依賴級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)腫瘤啟動。事實上TGF-β1的功能取決于腫瘤的分期。在正常的上皮細(xì)胞，它作為腫瘤抑制因子，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡；反之，當(dāng)腫瘤已存在時，則加快癌癥進(jìn)展。TGF-β可以作為任一種腫瘤的抑制因子或啟動子。在腫瘤發(fā)生初期TGF-β通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑的水平來抑制腫瘤細(xì)胞生長，但隨著惡性腫瘤的進(jìn)展，細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑水平不能抑制腫瘤生長時，腫瘤細(xì)胞開始產(chǎn)生大量的TGF-β，這時TGF-β成為腫瘤啟動子并通過Smad蛋白依賴性和非依賴性途徑誘導(dǎo)上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，TGF-β在間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮著中介作用，且TGF-β調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境。目前有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌小鼠模型接受放療或化療后體內(nèi)TGF-β1表達(dá)水平明顯增高并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，應(yīng)用抗TGF-β的單克隆抗體處理后乳腺癌小鼠模型中腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移明顯得到抑制[15-16]。證實TGF-β1水平高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

那么HOXC6是否也可以通過TGF-β信號通路參與腫瘤的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示過表達(dá)HOXC6肝癌細(xì)胞Huh-7細(xì)胞遷移數(shù)明顯高于未轉(zhuǎn)染HOXC6肝癌細(xì)胞Huh-7，證實肝癌細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)；行Western blot檢測及免疫熒光實驗，結(jié)果顯示過表達(dá)HOXC6肝癌細(xì)胞Huh-7與未轉(zhuǎn)染HOXC6肝癌細(xì)胞Huh-7相比，磷酸化Smad2表達(dá)明顯增加，Smad2/3表達(dá)則明顯減少，并且Smad2易位于細(xì)胞核。證實TGF-β信號通路中的關(guān)鍵蛋白Smad2被活化，TGF-β信號通路活性明顯增加。

綜上所述，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)HOXC6可以通過激活TGF-β信號通路增強(qiáng)其侵襲能力，證實HOXC6可以通過誘導(dǎo)TGF-β信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，這些將有可能為臨床腫瘤的治療提供一個潛在靶點，但TGF-β信號具體通過誘導(dǎo)那些基因發(fā)揮其作用，尚需進(jìn)一步深入研究來確定。

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(本文編輯：趙麗潔)

[中圖分類號]R394.26

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]B

[文章編號]1007-3205(2015)12-1420-05

[作者簡介]曹曉瑋(1977-)，女，河北邢臺人，河北省石家莊市第一醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士研究生，從事呼吸系統(tǒng)疾病診治研究。*通訊作者。E-mail:xi-xin-yan@163.com

[基金項目]石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃(141463243)

[收稿日期]2015-11-18；[修回日期]2015-12-04