綠原酸對心肌缺血-再灌注損傷的防護作用基礎(chǔ)研究

張 駿，楊小利，王紅勇

（中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內(nèi)科·重慶市心血管病研究所，重慶 400042）

綠原酸對心肌缺血-再灌注損傷的防護作用基礎(chǔ)研究

張 駿，楊小利，王紅勇

（中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內(nèi)科·重慶市心血管病研究所，重慶 400042）

目的 觀察綠原酸對SD大鼠心肌缺血-再灌注損傷的防護作用并分析其作用機制。方法 選取清潔級健康雄性SD大鼠16只（200～220 g）。隨機分為缺血-再灌注組（I／R組）和綠原酸干預(yù)組（CGA+I／R組），每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，CGA+I／R組給予灌胃綠原酸 50 mg／kg，I／R組給予同樣方法灌等量生理鹽水，連續(xù)飼養(yǎng)2周后建立在體心臟缺血-再灌注損傷模型，各組均缺血30 min，再灌注24 h后收集標本，心臟標本留取進行氯化三苯基四氮唑法（TTC）染色觀察心肌梗死面積，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELSIA)法檢測大鼠血清中乳酸脫氫酶（LDH）含量。同時，應(yīng)用H9C2細胞建立缺氧復(fù)氧損傷模型（缺氧8 h，復(fù)氧24 h），隨機分為3組，即對照組、缺氧復(fù)氧組（A／R組）和綠原酸干預(yù)組（CGA+A／R組）。復(fù)氧結(jié)束后，收集上清液及細胞，上清液利用ELISA法檢測炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子- （TNF- ），應(yīng)用qRT-PCR檢測收集細胞的IL-6及TNF- mRNA含量，96孔板中細胞應(yīng)用CCK-8檢測細胞活力。結(jié)果 與I／R組比較，CGA+I／R組能顯著減少心肌梗死面積[（23.97±2.8)%比(16.2±2.1)%，P＜0.05）]，抑制心肌酶釋放[（5 038±257.6)U／L比(4 005±206.8)U／L，P＜0.05）]；與 A／R組比較，CGA+A／R組能顯著減少細胞的損傷[（51.6±7.8)%比(69.7±6.6)%，P＜0.05）]，抑制炎癥因子的釋放（P＜0.05）。結(jié)論 綠原酸可通過抑制炎癥因子的釋放從而發(fā)揮對心肌缺血-再灌注損傷的防護作用。

綠原酸；心臟保護；缺血-再灌注損傷；炎癥因子

缺血性心臟病具有高致殘率和高死亡率的特點[1]，缺血-再灌注損傷是影響其預(yù)后的重要因素之一，如何預(yù)防已成為臨床研究熱點。缺血-再灌注損傷的機制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)是始動因素，也貫穿整個過程。既往研究證實，若能抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，即可顯著改善缺血-再灌注損傷[2]。綠原酸廣泛存在于高等雙子葉植物和蕨類植物中[3]，具有強烈的抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[4]，對大小鼠的腦缺血-再灌注損傷具有防護作用[5]。因此，筆者擬用綠原酸對心臟缺血-再灌注損傷進行防護，并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

綠原酸（成都曼思特生物科技有限公司，批號為 MUST-13031401）；2.5%戊巴比妥鈉、氯化三苯基四氮唑（TTC），均購自美國sigma公司。乳酸脫氫酶（LDH）以及白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。H9C2細胞株，由大坪醫(yī)院心血管內(nèi)科實驗室提供。

1.2 試驗方法

動物與分組：12周清潔級健康雄性 SD大鼠 16只，體重200～220 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供，動物合格證編號為41003100000258。SD大鼠隨機分為2組，即缺血-再灌注組（I／R組）和綠原酸干預(yù)組（CGA+I／R組，50 mg／kg），每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，CGA+I／R組給予灌胃50 mg／kg，I／R組同樣方法灌等量生理鹽水，連續(xù)2周。

缺血-再灌注損傷模型建立：以綠原酸及生理鹽水灌胃完成的SD大鼠，建立在體心臟缺血再灌注損傷模型。2.5%戊巴比妥鈉（50 mg／kg）腹腔注射麻醉，呼吸機輔助呼吸，備皮消毒，于左側(cè)胸腔第4，5肋間橫向剪開皮膚及第1層及2層肌肉，鈍性分離第3層肌肉，開胸器暴露心臟，分開心包膜，于左心耳下2～3 mm結(jié)扎（活結(jié)）前降支，關(guān)閉胸腔，30 min后打開胸腔，剪開結(jié)扎線，重新關(guān)閉胸腔，縫合皮膚，24 h后收集心臟標本及血液標本。

心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷模型建立：利用H9C2細胞建立心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷模型。H9C2細胞分別接種于96孔板和6孔板中，分為對照組（control組）、缺氧復(fù)氧組（A／R組），綠原酸組（CGA+A／R組）、A／R組與CGA+A／R組于接種24 h后在缺氧罐內(nèi)進行缺氧8 h，復(fù)氧24 h后收集上清及細胞標本，CCK-8檢測96孔板內(nèi)細胞活性。

1.3 檢測指標

TTC法檢測心肌梗死面積：配制1%TTC液體，將心臟標本從-80℃冰箱中取出，沿心尖到心底部平行切成 2 mm大小 5～7片，放入1%TTC液體中37℃水浴箱中溫孵15～20 min，存活心肌將染成紅色，梗死心肌為灰白色。染色完畢后，放入4%的多聚甲醛中固定48 h后照相，圖片用Image J軟件對心肌梗死面積進行統(tǒng)計。

ELISA法測定LDH，IL-6，TNF-α含量：檢測血清中的LDH含量以及細胞上清液中的LDH，IL-6，TNF-α含量，檢測步驟按照ELISA測定試劑盒說明進行。

QT-PCR法檢測表達水平：應(yīng)用Trizol法提取H9C2細胞總RNA，測定RNA濃度，然后進行逆轉(zhuǎn)錄。TNF-α，上游5’-CACCACGCTCTTCTGTCTACTGAAC3’，下游 5’CCGGACTCCGTGATGTCTAAGTACT3’； IL-6， 上 游 5’ CTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTG3’，下游 5’TGGTCTGTTGTGGGTGGTATCC3’；β-actin作為內(nèi)參，上游5’ACTATCGGCAATGAGCGGTTCC3’，下游5’CTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG3’。qRT-PCR檢測反應(yīng)系統(tǒng)依據(jù)TaKaRa公司RNA Kit（AMV）Ver 3.0說明步驟進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對心肌梗死面積的影響

在經(jīng)歷缺血30 min再灌注24 h后，利用TTC染色方法檢測心肌梗死面積。與I／R組比較，CGA+I／R組心肌梗死面積明顯減少[（23.97±2.8)% 比(16.2±2.1)%），P＜0.05]，見圖1。

圖1 各組心肌梗死面積統(tǒng)計分析

2.2 心肌酶譜釋放

通過ELISA方法檢測大鼠血清中LDH的含量發(fā)現(xiàn)，與I／R組比較，CGA+I／R組心肌酶釋放明顯減少[（5 038±257.6)U／L 比(4 005±206.8)U／L，P＜0.05]，見圖2。

圖2 各組血清LDH含量比較

2.3 心肌細胞缺氧復(fù)氧后細胞死亡

通過CCK-8檢測心肌細胞存活情況，發(fā)現(xiàn)CGA+A／R組心肌細胞活性明顯升高，且與 A／R組比較顯著提高[（51.6± 7.8)%比(69.7±6.6%），P＜0.05]，見圖3。

圖3 各組細胞活性比較

2.4 心肌細胞缺氧復(fù)氧后炎癥因子釋放結(jié)果見表1。

表1 各組IL-6及TNF- 含量比較（±s，n=5）

表1 各組IL-6及TNF- 含量比較（±s，n=5）

注：與Control組比較， P＜0.05；與A／R組比較，＃P＜0.05。

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2.5 綠原酸對TNF- 及IL-6 mRNA表達水平影響比較結(jié)果見圖4。

圖4 各組TNF- 和IL-6 mRNA的表達水平

3 討論

缺血性心臟病是指各種原因引起的冠狀動脈阻塞，從而導(dǎo)致心肌急性或長期缺血缺氧的疾病。缺血-再灌注損傷發(fā)生于缺血性心臟患者經(jīng)藥物或手術(shù)治療后，對預(yù)后有著極大的影響。且近年來，心臟缺血-再灌注損傷的治療在心血管系統(tǒng)研究領(lǐng)域一直處于熱點狀態(tài)，已建立諸多方法，如干細胞移植[6]、清除自由基[7]，但其安全性受到質(zhì)疑，急需尋找新的治療方案。

植物提取物治療效果逐漸被大家認識并受到關(guān)注。綠原酸是奎尼酸與反式肉桂酸縮合而成的酯類化合物家族，是植物有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于高等雙子葉植物和蕨類植物中，金銀花、蘋果、杜仲、綠茶、小麥、向日葵等植物中含量較高[3]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸具有廣泛的生物活性，如清除氧自由基、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等[8]，其中抗炎和抗氧化活性是綠原酸最重要的生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸能通過抑制炎癥因子的釋放減少脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的肺損傷[9-10]。此外，綠原酸能顯著減少腦缺血-再灌注造成的損傷，主要是通過抑制腦缺血后 TNF-α，IL-1β以及 IL-6等細胞因子的釋放，減少炎癥反應(yīng)，減輕對血腦屏障的破壞[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠原酸可顯著減少心肌梗死面積、抑制心肌酶的釋放；發(fā)現(xiàn)綠原酸還可顯著減少缺氧復(fù)氧造成的 H9C2細胞的損傷，并通過ELISA和 QT-PCR方法檢測炎癥因子水平，發(fā)現(xiàn)綠原酸可抑制炎癥因子的釋放。

綜上所述，綠原酸可通過抑制炎癥因子的釋放而發(fā)揮對心臟缺血-再灌注損傷的保護作用，且綠原酸來源于高等植物，并在日常飲食中含量高，故安全性高，具有一定實用價值。但本研究僅從基因及生化水平進行檢測，未能從蛋白組學(xué)進行研究，存在一定局限性，尚待進一步研究。

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Protective Effect of Chlorogenic Acid against Myocardial Ischemia／Reperfusion Injury

Zhang Jun，Yang Xiaoli，Wang Hongyong
（Department of Cardiology，Chongqing Institute of Cardiovascular Diseases，Institute of Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing，China 400042）

Objective To investigate the cardioprotective effects of chlorogenic acid against myocardial ischemia／reperfusion injury and to analyze its mechanism.Methods 16 healthy SD rats of clean grade（200～220 g）were selected and randomly devided into two groups：ischemia reperfusion group （I／R group）and chlorogenic acid （CGA+I／R）group，8 rats in each group.After one week′s adaptive feeding，rats in the CGA+I／R group were gavaged with 50 mg／kg CGA，while rats in the I／R group were gavaged with equivalent normal saline for 2 weeks.In vivo cardiac ischemia／reperfusion injury model were then built in each rat.All heart samples were collected after 30 mins′ischemia and 24 hours′reperfusion，and dyed with triphenyltetrazolium chloride（TTC）to observe the infarction area of myocardium.LDH content was also measured in rats serum by ELISA method.H9C2 cells were used to build anoxia／reoxygenation（A／R）injury model（8 hours′anoxia and 24 hours′reoxygenation）.Cells were randomly devided into 3 groups：the control group，A／R group and CGA+A／R group.Superate and cells were respectively collected after reoxygenation.Supernate was used to detect inflammatory factors like IL-6 and TNF-α by ELISA method，cells were used to quantify mRNA of IL-6 and TNF-α by qRTPCR.96-well plates cells were used to test cell viability by using CCK-8 method.Results Compared with the I／R group，the CGA+I／R group had significantly less infarction area[（23.97±2.8)% vs.(16.2±2.1)%，P＜0.05），less myocardial enzyme release[（5 038±257.6)U／L vs.(4 005±206.8)U／L，P＜0.05）]；when compared with the A／R group，the CGA+A／R group could remarkably reduce cell injury [（51.6±7.8)% vs.(69.7±6.6)%，P＜0.05）]，and inhibit the release of inflammatory factors. Conclusion CGA plays an protective effects on myocardial I／R injury via inhibiting the release of inflammatory factors.

chlorogenic acid；cardioprotective；ischemia reperfusion injury；inflammatory factor

張駿(1982-)，男，大學(xué)本科，主治醫(yī)師，主要研究方向為冠心病的發(fā)病機制及防治，(電話)023-68757800(電子信箱)zhangjun mj＠163.com；王紅勇(1965-)，男，博士研究生，主任醫(yī)師，教授，主要研究方向為動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)與臨床，本文通訊作者，(電話)023-68757214（電子信箱）whysir＠aliyun.com。

2015-03-17)

重慶市自然科學(xué)基金重點項目，項目編號：CSTC2011jjB10020。

R285.5；R282.71

A

1006-4931(2015)17-0003-03