甲狀腺毒癥患者單個(gè)核細(xì)胞Foxp3檢測(cè)分析

張 健 劉彥明 管振祺 何鳳屏

甲狀腺毒癥患者單個(gè)核細(xì)胞Foxp3檢測(cè)分析

張 健 劉彥明 管振祺 何鳳屏*

目的：檢測(cè)分析彌漫性毒性甲狀腺腫(Graves病)和亞急性甲狀腺炎患者單個(gè)核細(xì)胞叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)陽(yáng)性率和血漿甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(TPOAb)濃度變化。方法：采用流式細(xì)胞分析技術(shù)分別檢測(cè)32例Graves病患者(Graves病組)、27例亞急性甲狀腺炎患者(亞甲炎組)及30例健康對(duì)照者(對(duì)照組)外周血單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率；化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血漿TGAb、TPOAb水平，比較組間各指標(biāo)的差異，并分析Graves病患者單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率與血漿TGAb、TPOAb水平的相關(guān)性。結(jié)果：Graves病組單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率顯著低于對(duì)照組和亞甲炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Graves病組TGAb、TPOAb水平均明顯高于對(duì)照組和亞甲炎組，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Graves病患者單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率與血漿TGAb和TPOAb水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.70、-0.63,P<0.05)。結(jié)論：Foxp3、TGAb、TPOAb檢測(cè)可為Graves病與亞急性甲狀腺炎的診斷和鑒別診斷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

甲狀腺毒癥；叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3；甲狀腺球蛋白抗體；甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體

初診甲狀腺疾病多以甲狀腺毒癥為其主要表現(xiàn)，臨床上常見(jiàn)彌漫性毒性甲狀腺腫(Graves病)與甲亢期亞急性甲狀腺炎。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Forkhead/Winged Helix Transcription Factor3,Foxp3)作為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的特征性轉(zhuǎn)錄分子，在諸多疾病包括甲狀腺疾病發(fā)病中起著關(guān)鍵的作用[1]。本文通過(guò)流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)32例Graves病與27例甲亢期亞急性甲狀腺炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率，同時(shí)采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血漿甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(TPOAb)水平，并分析Foxp3與TGAb和TPOAb的相關(guān)性，為臨床診斷甲狀腺毒癥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

病例為2014-03—2014-11廣東省粵北人民醫(yī)院內(nèi)分泌科門(mén)診或住院患者。Graves病32例(Graves病組)，其中男10例，女22例，年齡18-64歲，平均39.2±9.7歲，診斷依據(jù)：有高代謝癥臨床表現(xiàn)；心率加快，甲狀腺腫大，手震顫，甲狀腺相關(guān)眼病表現(xiàn)，脛前黏液水腫等體征；FT4和FT3水平升高，TSH水平降低；甲狀腺靜態(tài)顯像ECT核素掃描顯示放射性攝取功能增加。甲亢期亞急性甲狀腺炎27例(亞甲炎組)，男7例，女20例，年齡19-66歲，平均40.6±10.0歲，診斷依據(jù)：有頸部疼痛或甲狀腺部位壓痛；C反應(yīng)蛋白或血沉水平升高；FT4和FT3增高，TSH水平降低；甲狀腺靜態(tài)顯像ECT核素掃描顯示放射性攝取功能減低，部分病例行細(xì)針穿刺活檢顯示可見(jiàn)大量多核巨細(xì)胞。所有病例半年內(nèi)均未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑或增強(qiáng)劑及放射碘治療的初診病人，且排除其它甲狀腺疾病及糖尿病、腎病、結(jié)核病等其它內(nèi)科疾病。選取同期于該院體檢中心體檢健康者30例作為對(duì)照組，男9例，女21例，年齡19-65歲，平均38.8±9.1歲。各疾病組和對(duì)照組間年齡、性別等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要儀器和試劑

流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，型號(hào)BD FACS Calibur)；電化學(xué)發(fā)光儀(瑞士Roche公司，型號(hào)E602)。藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人Foxp3單抗(美國(guó)eBioscience公司，批號(hào)E09963-300)，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體、別藻青蛋白(APC)標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體(美國(guó)BD公司，批號(hào)20131013/20130806)，人淋巴細(xì)胞分離液(上海華精高科技有限公司，批號(hào)110504)，含固定劑、溶血?jiǎng)┖屯改┑腜erfix-P試劑盒(美國(guó)貝克曼公司，批號(hào)B08488)，TGAb、TPOAb、FT3、FT4檢測(cè)試劑(瑞士Roche公司，批號(hào)173976/175454/175509/175155)。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率測(cè)定

抽取2ml外周血置入EDTA-K2抗凝管內(nèi)，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液提取單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入100μl固定液中振蕩混勻，室溫孵育10min后加裂解液500μl,充分混勻后放入37℃水浴箱孵育15min，加入冷洗滌液1ml, 2 000r/min離心4min后棄上清,加入90%甲醇1ml于冰上破膜30min，2 000r/min離心5min棄上清，最后加入冷洗滌液100μl重懸細(xì)胞。胞內(nèi)抗體可與膜表面抗體一起孵育染色, PE標(biāo)記的鼠抗人Foxp3抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體、APC標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體各20μl同時(shí)加入，孵育30min后洗滌、離心、棄上清液，加細(xì)胞重懸液500μl混勻。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以CD4設(shè)門(mén)分析單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率。

1.4 FT3、FT4及TGAb、TPOAb測(cè)定

所有對(duì)象采集3ml靜脈血于肝素鋰抗凝試管中，離心分離血漿，排除溶血及高脂血標(biāo)本，采用化學(xué)發(fā)光法，按常規(guī)操作，4h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率、TGAb、TPOAb、FT3、FT4水平比較

各組各指標(biāo)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與對(duì)照組和亞甲炎組比較，Graves病組患者單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率明顯降低，血漿TGAb、TPOAb水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與對(duì)照組比較：t=5.78、9.23、12.67；與亞甲炎組比較：t=4.81、6.59、12.18，P均<0.05)。對(duì)照組和亞甲炎組以上三指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.80、0.73、0.46，P均>0.05)。與對(duì)照組比較，Graves病組和亞甲炎組患者血漿FT3、FT4水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Graves病組：t=10.65、7.54；亞甲炎組：t=5.73、6.02，P均<0.05)。Graves病組患者血漿FT3水平較亞甲炎組升高更明顯(t=4.50，P<0.05)，兩組間血漿FT4水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.24，P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組Foxp3、TGAb、TPOAb、FT3、FT4檢測(cè)結(jié)果比較

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與亞甲炎組比較，2)P<0.05

2.2 Graves病患者Foxp3陽(yáng)性率與TGAb、TPOAb水平的相關(guān)性分析

Graves病患者單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率與血漿TGAb和TPOAb水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.70、-0.63,P均<0.05)。

3 討 論

甲狀腺毒癥是指組織暴露于過(guò)量甲狀腺激素中發(fā)生的以高代謝癥候群為臨床表現(xiàn)的一組綜合癥。Graves病與亞急性甲狀腺炎同為常見(jiàn)的甲狀腺疾病，兩者都可因甲狀腺激素水平升高而表現(xiàn)為甲狀腺毒癥。Graves病原發(fā)于自身免疫過(guò)程紊亂，致甲狀腺激素過(guò)度產(chǎn)生而引起甲狀腺毒癥[2]；亞急性甲狀腺炎急性發(fā)作期因甲狀腺濾泡的完整性被破壞，濾泡內(nèi)貯存的甲狀腺激素漏出使患者血循環(huán)中含量增多[3]。臨床上對(duì)這兩種不同原因甲狀腺疾病的鑒別診斷還未找到確切且簡(jiǎn)單易行的方法。

本文檢測(cè)結(jié)果顯示，Graves病與亞急性甲狀腺炎患者血漿FT3、FT4水平都較對(duì)照組明顯增高，而Graves病組FT3水平升高更顯著，其原因可能是Graves病患者自身甲狀腺功能高于正常水平，T4向T3轉(zhuǎn)化增強(qiáng)致T3及FT3增高；而亞急性甲狀腺炎患者的甲狀腺功能低于正常。張紅梅等[4]根據(jù)這一特點(diǎn)，通過(guò)FT3/FT4比值探討了鑒別Graves病和亞急性甲狀腺炎的分界值，但不管采用何種界值，兩者始終存在重合，說(shuō)明此鑒別方法雖然簡(jiǎn)單易行，但特異性不強(qiáng)。丁正強(qiáng)等[5]采用甲狀腺攝碘率鑒別亞急性甲狀腺炎和Graves病，靈敏度高，特異性強(qiáng)，但該方法檢查時(shí)間長(zhǎng)，且需內(nèi)服放射性藥物，對(duì)于妊娠期患者更是被禁止，因此在大多數(shù)醫(yī)院并不作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。

Graves病是一種器官特異性自身免疫性疾病，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，機(jī)制亦未完全闡明，有研究表明其可能與TGAb、TPOAb水平升高密切相關(guān)[6]。Foxp3特異且穩(wěn)定地表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞亞群,是其敏感標(biāo)記，對(duì)CD4+CD25+Treg發(fā)育和發(fā)揮免疫抑制作用具有重要影響，可能是Graves病發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要因素[7,8]。亞急性甲狀腺炎患者多有上呼吸道感染史，一般認(rèn)為與病毒感染有關(guān)；也有學(xué)者提出該病患者甲狀腺組織受炎癥破壞后釋放出自身抗原，可通過(guò)直接或間接方式激活輔助性T淋巴細(xì)胞，因此伴隨病毒事件的同時(shí)不排除自身免疫異常[9]。本文結(jié)果顯示，Graves病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率較對(duì)照組和亞甲炎組患者明顯降低，與錢(qián)偉等[10]研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析顯示外周血單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率與血漿TGAb、TPOAb水平均呈負(fù)相關(guān)，提示Graves病患者外周血CD4+CD25+Tregs數(shù)量減少或者Treg功能受損，導(dǎo)致免疫耐受機(jī)制破壞，持續(xù)激活體內(nèi)自身反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)自身甲狀腺組織免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量TGAb和TPOAb，使血漿水平較對(duì)照組顯著增高，與吳定昌等[11]研究結(jié)果基本一致。有關(guān)Foxp3與亞急性甲狀腺炎的研究少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本文檢測(cè)結(jié)果顯示亞甲炎組患者單個(gè)核細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性率與對(duì)照組接近，同時(shí)外周血TGAb、TPOAb的水平亦與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與汪亞麗[12]觀察到的結(jié)果相同，該結(jié)果有利于進(jìn)一步補(bǔ)充其與Graves病的鑒別診斷方法。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

張 健(1977-)，男，漢族，碩士，主管技師

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汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，韶關(guān) 512026；*

，E-mail：fengphe@hotmail.com

本文2014-12-18收到，2015-02-17修回

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1005-1740(2015)02-0049-03