彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者尿液中揮發(fā)性標(biāo)志物的篩選

花慶嶺，王 霖，劉 蟬，韓玲玲，曾慶曙，楊明珍，夏瑞祥，潘躍銀，張亞中，劉 虎

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者尿液中揮發(fā)性標(biāo)志物的篩選

花慶嶺1，王 霖2，劉 蟬3，韓玲玲3，曾慶曙2，楊明珍2，夏瑞祥2，潘躍銀1，張亞中3，劉 虎1

摘要目的 篩選彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）患者尿液中有診斷價(jià)值的揮發(fā)性標(biāo)志物（VOCs）。方法 收集35例DLBCL患者尿液樣本（DLBCL組），30例健康者尿液樣本（對(duì)照組）。利用頂空氣體固相微萃取聯(lián)用氣相色譜－質(zhì)譜檢測(cè)分析兩組尿液樣本中的揮發(fā)性有機(jī)化合物。應(yīng)用Wilcoxon非參數(shù)檢驗(yàn)分析篩選DLBCL患者尿液中的特異性VOCs。結(jié)果 篩選出正己烷、2-丁酮和4-庚酮3種特異性揮發(fā)性標(biāo)志物。DLBCL組正己烷的濃度為（63.45±9.98）μg／ml，2-丁酮的濃度為（105.43±12.81）μg／ml，4-庚酮的濃度為（162.56±25.38）μg／ml。3種物質(zhì)的濃度在DLBCL組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 DLBCL患者尿液中揮發(fā)性化合物（正己烷、2-丁酮和4-庚酮）可能是有診斷價(jià)值的VOCs。

關(guān)鍵詞彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；尿液；揮發(fā)性標(biāo)志物；氣相色譜－質(zhì)譜

2014－12－29接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，2血液內(nèi)科，合肥230022

3安徽省食品藥品檢驗(yàn)所，合肥 230051

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常見(jiàn)的B細(xì)胞來(lái)源惡性淋巴瘤［1］。目前DLBCL的診斷主要依靠病理，但其存在很多不足之處。首先病理取材有創(chuàng)性，不易為患者接受；再者DLBCL的病理異質(zhì)性極強(qiáng)，診斷上主要依靠病理醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)判斷，極易造成誤診。該研究擬采用頂空氣體的固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）和氣相色譜－質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)DLBCL患者和健康對(duì)照者尿液中的揮發(fā)性標(biāo)志物（volatile organic compounds，VOCs）進(jìn)行定量分析比較，檢測(cè)兩者之間的差異，旨在DLBCL患者尿液中篩查出有診斷價(jià)值的特異性VOCs。

1 材料與方法

1．1 病例資料 收集2014年3月～6月入住安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的DLBCL患者尿液樣本35例（DLBCL組），其中男24例，女11例，年齡37～71 （54.3±8.4）歲。DLBCL均以病理證實(shí)，其中早期

（Ⅰ／Ⅱ）患者16例，中晚期（Ⅲ／Ⅳ）患者19例?；颊呔鶠槌踉\初治，近期無(wú)泌尿系統(tǒng)感染、無(wú)其他腫瘤病史、無(wú)糖尿病、腎病、自身免疫性疾?。ㄈ珙?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）。另同期選擇30例健康者，其中男21例，女9例，年齡40～75（57.1± 11.7）歲，收集其尿液樣本（對(duì)照組）。對(duì)照組為患者家屬，均經(jīng)體檢證實(shí)身體健康。兩組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有受試者簽署知情同意書(shū)。

1．2 主要儀器與試劑 GC-MS聯(lián)用儀（GC-MS QP 2010 Plus）、20 ml頂空瓶購(gòu)自日本Shimadzu公司；手動(dòng)進(jìn)樣57330U型SPME手柄及57318型75 μm CAR-PDMS SPME萃取頭購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；HP-5MS毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm× 0.25 μm）購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；正己烷、2-丁酮和4-庚酮（色標(biāo)，＞98%）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用水為Milli-Q純水系統(tǒng)生產(chǎn)。

1．3 尿液收集方法 每位受試者夜間24：00后禁食禁水，清晨起床后留取新鮮中段尿密封在15 ml標(biāo)本管中。收集完畢的尿液標(biāo)本在1 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1．4 尿液樣品預(yù)處理及萃取方法 取10 ml尿液置入頂空瓶中，加蓋密封，SPME萃取頭插入頂空瓶，置入40℃恒溫箱中靜置萃取30 min。萃取后，將萃取頭手動(dòng)插入GC-MS進(jìn)樣口，解析5 min再讀數(shù)據(jù)。同時(shí)取10 ml純水按相同步驟處理，作為空白對(duì)照，消除空氣中VOCs的干擾。

1．5 色譜與質(zhì)譜條件 柱箱初溫：35℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；柱流速：1 ml／min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；柱箱程序升溫：35℃保持2 min，以6℃／min速度升至150℃，再以12℃／min升至250℃，保持3 min。質(zhì)譜離子源溫度：200℃；接口溫度：220℃；溶劑切除時(shí)間：1 min；掃描范圍：45～350 m／z。

1．6 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 分別抽取4、2、1 ml、500、250 μl的色譜純正己烷、2-丁酮和4-庚酮注入頂空瓶，加甲醇水溶液（純水∶甲醇＝1∶1）配制到10 ml后密封。

1．7 實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定性測(cè)定與定量方法 用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，根據(jù)目標(biāo)VOCs成分最大和最小色譜峰值面積，首先配置相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，然后配置該范圍內(nèi)5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)色譜峰面積值，每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的色譜峰面積測(cè)2次，計(jì)算其平均值；以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)建立線性回歸方程。研究對(duì)象尿液中的VOCs的濃度＝尿液VOCs測(cè)量濃度－實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的VOCs濃度。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，選用線性回歸建立回歸方程，篩選比較物質(zhì)采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Wilcoxon檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05）。

2 結(jié)果

2．1 尿液中VOCs的分析 按照步驟1．5中的GC-MS條件對(duì)尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)，選取保留時(shí)間在0～32 min的總離子流程圖，通過(guò)NIST 05數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析，將DLBCL患者和健康對(duì)照者尿液中VOCs色譜圖相比較，篩選出正己烷、2-丁酮和4-庚酮3種有明顯差異的VOCs。見(jiàn)圖1、2。

2．2 尿液中VOCs濃度比較 通過(guò)定量檢測(cè)兩組尿液中正己烷、2-丁酮和4-庚酮的濃度，DLBCL組患者尿液中上述3種VOCs的濃度與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1　DLBCL組與對(duì)照組尿液中VOCs濃度比較（μg／ml，±s）

表1　DLBCL組與對(duì)照組尿液中VOCs濃度比較（μg／ml，±s）

VOCs　DLBCL組　　對(duì)照組　P值63．45±9．98　83．45±10．99　?。?．05 2-丁酮　105．43±12．81　66．02±15．64　?。?．05 4-庚酮正己烷162．56±25．38　62．74±20．60　?。?．05

2．3 尿液中特異性VOCs用于DLBCL診斷的價(jià)值 根據(jù)受試者工作曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評(píng)估正己烷、2-丁酮和4-庚酮在DLBCL患者和健康對(duì)照者之間的診斷能力。正己烷曲線下面積（area under curve，AUC）為0.888，敏感度為90.6%，特異度為85.2%；2-丁酮AUC為0.973，敏感度為83.9%，特異度為96.0%；4-庚酮AUC為0.924，敏感度為93.9%，特異度為85.2%。見(jiàn)表2、圖3。

表2　3種標(biāo)志物在DLBCL和健康對(duì)照者之間的診斷價(jià)值

2．4 重現(xiàn)性和線性 配制濃度為0.66 μg／ml的正己烷樣品，濃度為0.81 μg／ml的2-丁酮樣品和濃度為0.82 μg／ml的4-庚酮各5份，按上述方法吸附、分析，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝5），正己烷為4.8%，2-丁酮為3.7%，4-庚酮為0.9%。對(duì)1.6步驟中配制的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分析，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），濃度為橫坐標(biāo)（x），進(jìn)行線性回歸。正己烷的回歸方程為＾y＝2.64×106x－7.51×105，

R2＝0.930；2-丁酮的回歸方程為＾y＝2.92×107x－1.15×106，R2＝0.991；4-庚酮的回歸方程為＾y＝3.98×107x－6.36×106，R2＝0.998。

3 討論

人尿液中含有280余種VOCs，通過(guò)檢測(cè)其組分的改變可以診斷疾病［2］。尿液VOCs分析具有簡(jiǎn)單無(wú)創(chuàng)、快捷方便的優(yōu)點(diǎn)，正逐漸成為腫瘤的一項(xiàng)新興篩查方法，隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)篩查出部分與腫瘤相關(guān)的揮發(fā)性標(biāo)記物作為疾病的參考診斷指標(biāo)［3－4］。

本研究使用SPME聯(lián)合GC-MS法檢測(cè)DLBCL患者尿液及健康對(duì)照者尿液中VOCs。經(jīng)定量分析篩選出3種VOCs：正己烷、2-丁酮和4-庚酮。3者相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.8%、3.7%和0.9%，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.930、0.991和0.998，表明該檢測(cè)方法有良好的重現(xiàn)性和線性。2-丁酮和4-庚酮在DLBCL患者尿液中濃度均顯著高于健康對(duì)照者，診斷靈敏度可達(dá)83.9%和93.9%，特異度為96.0%和85.2%；正己烷在患者尿液中濃度低于健康對(duì)照者，診斷靈敏度可達(dá)90.6%，特異度為85.2%，可能作為DLBCL初篩的理想標(biāo)志物。

尿液中VOCs來(lái)源有2種：外源性和內(nèi)源性。外源性多為大氣污染、食物飲食中有機(jī)物，內(nèi)源性VOCs一般認(rèn)為由細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸與氧自由基發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生［5］。腫瘤細(xì)胞中氧自由基活性增加［6］，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致VOCs生成較正常細(xì)胞明顯增多。此外，腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞色素P450混合酶系統(tǒng)也可能改變某些VOCs的代謝過(guò)程，導(dǎo)致特異性VOCs的產(chǎn)生［7］。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中大多腫瘤細(xì)胞存在氧化應(yīng)激增強(qiáng)的現(xiàn)象，即使微小的病灶也可能存在較強(qiáng)的氧化應(yīng)激，表明VOCs在早期診斷腫瘤上可能更有優(yōu)勢(shì)［8］。

本研究篩查出的正己烷屬于直鏈飽和脂肪烴類(lèi)，主要用于丙烯等烯烴聚合時(shí)的溶劑、食用植物油的提取劑、橡膠和涂料的溶劑以及顏料的稀釋劑。Cozzolino et al［9］發(fā)現(xiàn)自閉癥兒童尿液中的正己烷濃度明顯高于正常兒童，其可能由脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生。本研究顯示DLBCL患者尿液中的正己烷濃度明顯低于健康對(duì)照者，推測(cè)其產(chǎn)生除氧化應(yīng)激外另受到細(xì)胞色素P450混合酶調(diào)控，其可能被進(jìn)一步氧化而降低濃度［10］。2-丁酮和4-庚酮皆屬于酮類(lèi)，一般認(rèn)為由脂肪酸的過(guò)氧化有關(guān)，DLBCL患者體內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，進(jìn)而產(chǎn)生更多的2-丁酮和4-庚酮等酮類(lèi)。

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The screening of urinary volatile markers for diffuse large B-cell lymphoma

Hua Qingling1，Wang Lin2，Liu Chan3，et al
（1Dept of Oncology，2Dept of Hemotology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；3Anhui Institute for Food and Drug Control，Hefei 230051）

AbstractObjective To screen urinary volatile organic compounds（VOCs）in diffuse large B-cell lymphoma（DLBCL）patients．Methods The urine samples were collected from 35 DLBCL patients and 30 healthy controls．VOCs were extracted with head space solid phase micro-extract（SPME）combined with the gas chromatography （GC）-masss pectrometry（MS）．The non-parametric Wilcoxon test was used for discriminating the VOCs and assessing the statistical significance．Results Hexane，2-butanone and 4-heptanone were found as the specific VOCs for DLBCL．The concentration range of the hexane was（63.45±9.98）μg／ml，and the concentration range of 2-butanone was（105.43±12.81）μg／ml．As for the concentration range of 4-heptanone，it was（162.56±25.38）μg／ml．The concentration of the three VOCs was significantly different between DLBCL patients and healthy controls（P ＜0．05）．Conclusion Hexane，2-butanone and 4-heptanone may be the latent volatile biomarkers for the diagnosis of patients with DLBCL．

Key wordsdiffuse large B-cell lymphoma；urinie；volatile organic compounds；gas chromatography-mass spectrometry

作者簡(jiǎn)介：花慶嶺，男，碩士研究生；劉 虎，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：drliuhu＠gmail．com

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）04－0522－04

中圖分類(lèi)號(hào)R 730．4；R 733．4