注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉含量測(cè)定方法的研究

董 靜，聶穎杰，李三紅*南京市口腔醫(yī)院（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院），南京 0008；南京優(yōu)科生物醫(yī)藥有限公司，南京0000

注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉含量測(cè)定方法的研究

董 靜1，聶穎杰2，李三紅1*
1南京市口腔醫(yī)院（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院），南京 210008；2南京優(yōu)科生物醫(yī)藥有限公司，南京210000

目的：建立同時(shí)測(cè)定注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉中頭孢曲松和他唑巴坦含量的方法。方法：色譜柱為DIKMA Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-10%四丁基氫化銨溶液（995∶5），用磷酸調(diào)pH至3.0，流動(dòng)相B為乙腈-甲醇（1∶2），以A∶B=70∶30作為流動(dòng)相；波長(zhǎng)為230 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃。結(jié)果：頭孢曲松和他唑巴坦之間的分離度為2.89，頭孢曲松和反式頭孢曲松的分離度為12.41；經(jīng)酸、堿、氧化、高溫和光照破壞試驗(yàn)表明，頭孢曲松和他唑巴坦與其它雜質(zhì)的分離度良好。頭孢曲松和他唑巴坦在線性范圍內(nèi)進(jìn)樣量和峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為1和0.9999；平均加樣回收率分別為100.3%和99.5%，RSD分別為0.90%和0.66%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，專(zhuān)屬性和耐用性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可同時(shí)測(cè)定注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉中頭孢曲松和他唑巴坦的含量。

高效液相色譜法；頭孢曲松；他唑巴坦；含量測(cè)定

注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉是頭孢曲松和他唑巴坦按3∶1（w/w）組成的復(fù)方制劑。頭孢曲松鈉為第三代頭孢菌素類(lèi)抗生素，能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成而起到殺菌作用，但易被β-內(nèi)酰胺酶水解而失去活性；他唑巴坦鈉對(duì)β-內(nèi)酰胺酶有抑制作用，兩者聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同抗菌作用，適用于對(duì)頭孢曲松耐藥、對(duì)本復(fù)方敏感的β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌引起的中重度感染。根據(jù)Mohnarin年度報(bào)告：我國(guó)臨床分離菌耐藥性較為嚴(yán)重，特別是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）的腸桿菌科細(xì)菌，在臨床上十分普遍。

注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉可有效克服因ESBLs引起的耐藥，并能阻斷或延緩耐藥的繼續(xù)發(fā)展，是一個(gè)安全、有效，臨床運(yùn)用廣泛的復(fù)方抗生素[1]。原標(biāo)準(zhǔn)采用反相高效液相色譜法測(cè)定了兩者的含量，但未對(duì)反式頭孢曲松進(jìn)行有效的分離，影響了含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。

本文重新建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定頭孢曲松和他唑巴坦含量的方法，對(duì)酸、堿、氧化和高溫破壞后的雜質(zhì)和兩個(gè)主峰的分離情況進(jìn)行了研究，規(guī)定了頭孢曲松和反式頭孢曲松的分離度，提高了含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-1260高效液相色譜系統(tǒng) （含1260 Quat PumpVL泵，1260ALS自動(dòng)進(jìn)樣器，1260TCC控溫箱，1260VWD紫外檢測(cè)器和OpenLAB色譜工作站，安捷倫）；AL204型電子分析天平（德國(guó)梅特勒儀器公司）；BP211D型電子分析天平 （德國(guó)賽多利斯儀器公司）；320-SpH計(jì)〔梅特利－托利多儀器（上海）有限公司〕。

1.2 試藥

頭孢曲松對(duì)照品（純度83.7%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130480-200903）；他唑巴坦對(duì)照品（純度99.1%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130511-200402）；反式頭孢曲松對(duì)照品 （純度：99.4%，僅供HPLC系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130660-201001）；注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉粉針劑（3∶1）（南京優(yōu)科制藥有限公司，批號(hào)：20120401、20120402、20120403）。

磷酸二氫鉀和10%四丁基氫化銨為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，購(gòu)自Merck公司；其余試劑為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2-6]

色譜柱為DIKMA-C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-10%四丁基氫化銨溶液（995∶5）的混合液（4.08 g磷酸二氫鉀加5 mL 10%四丁基氫氧化銨溶液，加水稀釋至1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0），流動(dòng)相B為甲醇-乙腈=2∶1（v/v）的混合溶液，以A∶B=70∶30（v/ v）；柱溫為30℃；波長(zhǎng)為230 nm；流速為1.0 mL· min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白對(duì)照溶液 以流動(dòng)相做為空白對(duì)照溶液。

2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液 取頭孢曲松對(duì)照品、反式頭孢曲松對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中約含頭孢曲松1.5 mg、反式頭孢曲松15 μg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液 取頭孢曲松、他唑巴坦對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL分別含頭孢曲松1.5 mg、他唑巴坦0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液 精密稱(chēng)取100 mg（相當(dāng)于頭孢曲松75 mg，他唑巴坦25 mg），置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性

精密量取空白對(duì)照溶液、系統(tǒng)適用性溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中頭孢曲松和他唑巴坦的理論塔板數(shù)分別為5556和8136；分離度分別為14.51和2.89；色譜圖中頭孢曲松和反式頭孢曲松的分離度為12.41；空白對(duì)照對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉適量，分別進(jìn)行酸、堿、高溫、氧化和光破壞后，照供試品溶液制備方法制備樣品溶液。考察在現(xiàn)有分析條件下降解產(chǎn)物和頭孢曲松與他唑巴坦主峰的分離度。結(jié)果：本品經(jīng)堿、氧化、高溫、光照破壞后降解產(chǎn)物有明顯增加，酸破壞后降解產(chǎn)物沒(méi)有明顯增加，降解產(chǎn)物與頭孢曲松、他唑巴坦能完全分離。見(jiàn)圖2。

2.5 線性范圍

取頭孢曲松對(duì)照品和他唑巴坦對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成約含頭孢曲松1.5 mg·mL-1、他唑巴坦0.5 mg·mL-1的溶液，作為線性對(duì)照品溶液。分別取溶液2、5、8、10、12、15 μL依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。頭孢曲松回歸方程：Y=2765.3X+66.19，r=1，線性范圍為3.0～22.5 μg；他唑巴坦回歸方程：Y=342.78X+ 16.031，r=0.9999，線性范圍為1.0～7.5 μg。

2.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取線性試驗(yàn)項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，精密量取10 μL依次注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，頭孢曲松和他唑巴坦峰面積的RSD分別為0.82%和0.51%。試驗(yàn)結(jié)果表明，本法進(jìn)樣精密度良好。

2.7 定量限考察

取頭孢曲松對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成約含頭孢曲松1.5 mg·mL-1的溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)M(jìn)行測(cè)定，按信噪比10∶1，確定頭孢曲松的最小定量限為0.15 ng。

取他唑巴坦對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成約含他唑巴坦0.5 mg·mL-1的溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)M(jìn)行測(cè)定，按信噪比10∶1，確定他唑巴坦的最小定量限為1.00 ng。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：20120401）適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相溶解并制成每毫升含頭孢曲松1.5 mg、含他唑巴坦0.5 mg的溶液，作為供試品溶液，共配制6份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果按無(wú)水物計(jì)，頭孢曲松和他唑巴坦的含量分別為710 μg·mg-1和233 μg·mg-1，RSD分別為0.97%和1.52%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：20120401），加流動(dòng)相制成每毫升含頭孢曲松1.5 mg、含他唑巴坦0.5 mg的溶液，作為供試品溶液，置于溫度為5℃自動(dòng)進(jìn)樣器，分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測(cè)定。頭孢曲松和他唑巴坦峰面積RSD分別為0.65%和0.59%，表明供試品溶液在5℃條件下12 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

按照供試品溶液80%、100%、120%的濃度配制高、中、低三個(gè)樣品溶液，每個(gè)溶液配制3份，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。頭孢曲松和他唑巴坦的平均回收率分別為100.3%和99.5%，RSD（n= 9）分別為0.90%和0.66%。

2.11 耐用性考察

分別考察了鹽用量、柱溫、流速、pH值、四丁基氫氧化銨用量、流動(dòng)相比例和波長(zhǎng)在±5%范圍內(nèi)變化及采用不同的色譜柱對(duì)本品的含量測(cè)定的影響。上述不同條件下，頭孢曲松和他唑巴坦的平均含量分別為101.7%和99.6%，RSD（n=3）分別為0.17%和0.17%。表明本法耐用性良好，微調(diào)鹽用量、柱溫、流速、pH值、四丁基氫氧化銨用量、流動(dòng)相比例和波長(zhǎng)及更換不同廠家的色譜柱，均對(duì)本品含量測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

2.12 注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉（3∶1）含量測(cè)定

取注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉（3∶1）三批（批號(hào)：20120401、20120402、20120403），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定頭孢曲松和他唑巴坦含量，見(jiàn)表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 含量測(cè)定結(jié)果（n=6）

3 討 論

參考《中國(guó)藥典》他唑巴坦質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、《美國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)[2-3]，對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行了篩選，分別試用了中國(guó)藥典方法和美國(guó)藥典的方法，根據(jù)系統(tǒng)適用性結(jié)果，最終以中國(guó)藥典方法為基礎(chǔ)建立了上述含量測(cè)定的方法。中國(guó)藥典方法和調(diào)整后的方法結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表3。

在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，因?yàn)橐瑫r(shí)測(cè)定頭孢曲松和他唑巴坦的含量，檢測(cè)波長(zhǎng)需要滿(mǎn)足兩個(gè)成分均有吸收的條件。我們分別取頭孢曲松對(duì)照品、他唑巴坦對(duì)照品適量，加流動(dòng)相配制成10 μg·mL-1的溶液，照紫外分光光度法，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外掃描，頭孢曲松的最大吸收波長(zhǎng)為245 nm，由于他唑巴坦在245 nm處無(wú)吸收，且兩組分的配比為3∶1，故選擇他唑巴坦吸收較強(qiáng)的230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本文建立的注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉含量測(cè)定的色譜條件，是基于頭孢曲松、他唑巴坦與主要雜質(zhì)分離度試驗(yàn)及破壞性試驗(yàn)等方法學(xué)研究上得到的優(yōu)化結(jié)果，其靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，能夠同時(shí)測(cè)定本品中頭孢曲松和他唑巴坦的含量。

表3 中國(guó)藥典方法和調(diào)整后的方法結(jié)果對(duì)比

[1] 肖永紅，沈 萍，魏澤慶，等.Mohnarin 2011年度全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè) [J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（22）：4946-52.

[2] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄194-5.

[3] 美國(guó)藥典中文版第2卷 [S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，USP34-NF29：1924-5.

SimultaneousDetermination ofCeftriaxoneand Tazobactam Contentin Ceftriaxone Sodium and Tazobactam Sodium(3∶1)for Injection

DONG Jing1,NIE Ying-jie2,LI San-hong1*
1Nanjing Stomatological Hospital,Medical School of Nanjing University,Nanjing 210008;2Nanjing Yoko Pharmaceutical Co.Ltd,Nanjing 210000

Objective:To establish a new method for simultaneous determination of ceftriaxone and tazobactam contents in ceftriaxone sodium and tazobactam sodium (3∶1)for injection.Methods:A DIKMA Diamonsil C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm)was used with the mobile phase consisted of mobile phase A∶mobile phase B (70∶30)at a flow rate of 1.0 mL·min-1,and the detection wavelength was set at 230 nm. The mobile phase A consisted of 0.03 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate and 10%tetrabutyl ammoni-um hydroxide(995∶5,pH 3.0),the mobile phase B consisted of acetonitrile and methanol(1∶2).The column temperature was 30℃.Results:Ceftriaxone and tazobactam were well-separated,and the separation degree between them was 2.89.The separation degree between ceftriaxone and trans-ceftriaxone was 12.41.Ceftri-axone and tazobactam were separated very well from their impurities under the condition of acid,alkali, oxidation,high temperature or light damage.Ceftriaxone and tazobactam showed good linear relationship be-tween sampled amount and peak area in the linear range of calibration curve,and the correlation coeffi-cients were 1 and 0.9999.The average recoveries were 100.3%and 99.5%,RSD were 0.90%and 0.66%. Conclusion:This method is simple,specific,accurate and can be used for simultaneous determination of ceftriaxone and tazobactam in the ceftriaxone sodium and tazobactam sodium(3∶1)for injection.

High performance liquid chromatography (HPLC);Ceftriaxone;Tazobactam;Content deter-mination

R927.2

A

1673-7806（2015）02-131-04

董靜，女，主管藥師 E-mail:tokyodj@yeah.net

*通訊作者李三紅，女，副主任中藥師 E-mail:lshaaaa@163.com

2014-10-20

2014-11-13