耐鹽堿石油降解菌2JQ的分離鑒定及降解能力研究

楊慶麗，董 艷，姬妍茹，田 媛，張正海

(黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

?

耐鹽堿石油降解菌2JQ的分離鑒定及降解能力研究

楊慶麗，董 艷，姬妍茹，田 媛，張正海

(黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

從大慶地區(qū)石油污染土壤分離出一株石油降解菌命名為2JQ，經(jīng)16SrDNA及理化檢測鑒定為糞產(chǎn)堿菌，采用氣相色譜法(GC)對該菌石油及石油烴正十二烷、正十四烷、正十六烷、正二十烷、正三十二烷降解效率進行研究，測定該菌在高鹽及高pH條件下生長情況。結(jié)果表明，2JQ菌株對石油降解率達到67.1%，5種石油烴降解率分別為68.21%、64.70%、58.04%、49.73%、19.87%。該菌在高鹽、高pH條件下生長良好，適合在大慶地區(qū)鹽堿土壤中進行石油污染降解。

石油降解菌；石油；石油烴；降解率

石油是世界上最重要的能源之一，對全球經(jīng)濟發(fā)展起到了重要的推動作用。隨著需求量的逐年增大，石油在開采、運輸和加工過程中對于土壤和水體的污染也日益嚴重。石油污染不僅給國家經(jīng)濟帶來巨大損失，也對人體健康造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[1]。目前對于石油污染的各種治理方法中，微生物降解因其費用低、原位降解污染物、無二次污染等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用[2]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)能夠降解石油的微生物有70個屬、200多種，其中細菌有假單胞菌屬、棒桿菌屬、微球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等[3]。

大慶是我國主要石油產(chǎn)地，年產(chǎn)量近4 000萬t。近年來隨著城市建設(shè)的發(fā)展，石油污染降解問題也得到了越來越多的重視。大慶地區(qū)土壤多為鹽堿土，外來石油降解菌很難存活。該研究從大慶油田井架旁邊石油污染土壤中分離一株石油降解糞產(chǎn)堿菌，研究其對于石油及石油烴降解性能，以期為大慶石油污染的生物修復(fù)做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1采樣及石油來源。試驗中所用原油及石油污染土樣均來自大慶油田采油一廠。

1.1.2培養(yǎng)基。無機培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2·2H2O 0.02 g/L、KH2PO41 g/L、NH4NO31 g/L、KNO31 g/L、FeCl30.05 g/L，pH 7.0[4]。石油培養(yǎng)基：在無機鹽培養(yǎng)基中加入0.5 %的滅菌石油。石油烴培養(yǎng)基：在100 ml無機培養(yǎng)基中加入正十二烷(C12H26)、正十四烷(C14H30)、正十六烷(C16H34)各1 ml，正二十烷(C20H42)、正三十二烷(C32H66)各0.5 g。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。固體培養(yǎng)基為加入瓊脂12 g/L。

1.1.3試驗試劑。細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒：上海生工；DNA Marker 2 000 bp：北京原平皓；正十二烷、正十四烷、正十六烷、正二十烷、正三十二烷：天津市津科精細化工研究所；其他試劑均采用國產(chǎn)分析純。

1.1.4試驗儀器。7900氣相色譜儀、臺式高速冷凍離心機：上海天美；凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀：北京君意東方；基因擴增儀：杭州博日；UV-759紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1石油降解菌分離。在100 ml石油培養(yǎng)基中加入2 g石油污染土樣，30 ℃搖床培養(yǎng)7 d。避開原油取1 ml上層培養(yǎng)液接到100 ml石油培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d。再重復(fù)一次。取培養(yǎng)液梯度稀釋106、107、108倍，涂布牛肉膏蛋白胨平板上，獲得生長較好優(yōu)勢菌株，純化后命名斜面保存。其中一株優(yōu)勢菌命名為2JQ，純化培養(yǎng)后進行下一步試驗。

1.2.2石油降解率測定。取0.1 ml 2JQ培養(yǎng)液接種到100 ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)16 h。1 ml上述培養(yǎng)液接種到100 ml石油培養(yǎng)基中，以不接菌石油培養(yǎng)基為空白對照，取3個重復(fù)，30 ℃搖床培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)液每次加入20 ml色譜純正已烷超聲離心萃取3次，每次15 min，合并萃取液，揮干后加入10 ml色譜純正已烷，空白對照萃取方法同上。氣相色譜法測定石油降解率。7900氣相色譜儀配備FID檢測器和SE30色譜柱(100 m×0.32 mm×0.5 μm)，載氣為氮氣，柱流量2 ml/min，總流量50 ml/min。進樣口溫度280 ℃，進樣1 μl，檢測器溫度320 ℃，升溫程序：60 ℃保持3 min，以6 ℃/min升溫至220 ℃保持2 min，再以2 ℃/min升至320 ℃，保持45 min。面積歸一法測定石油降解。

1.2.3石油降解菌16SrDNA鑒定。取2JQ菌株培養(yǎng)液1 ml，10 000 r/min 離心1 min獲得菌體，上海生工細菌總DNA提取試劑盒提總DNA，通用引物Eubac27F，1492R進行16SrDNA擴增[5]。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，共進行35個循環(huán)，再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物測序由上海生工完成，MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4石油烴降解測定。2JQ活化后，取1 ml加入100 ml石油烴培養(yǎng)基中，取3個重復(fù)，以不接菌石油烴培養(yǎng)基為空白對照，搖床培養(yǎng)7 d。用氣相色譜法測定石油烴降解率。萃取及氣相色譜條件同“1.2.2”。

1.2.5菌種耐鹽堿性研究。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中另外加入1%及2%的NaCl，100 ml/瓶分裝各16瓶，調(diào)pH為7、8、9、10、11，各設(shè)3個重復(fù)。以不接菌pH 11的培養(yǎng)基為空白對照，OD600測定24 h細菌生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油降解率測定無菌的空白對照與接菌的無機培養(yǎng)基在完全相同的條件下培養(yǎng)，7 d時空白對照水油仍然分離，上層原油粘度較高呈黑色；接種了2JQ菌株的三角瓶中水油已經(jīng)融合，粘度降低，顏色由黑色變?yōu)楹稚?。圖1為石油降解氣相色譜圖。結(jié)果顯示，7 d菌株2JQ石油降解率為67.1%。

2.2 石油降解菌鑒定2JQ為革蘭氏陰性菌桿狀菌，菌落圓形，表面光滑，白色略透明。PCR電泳結(jié)果見圖2；該菌16SrDNA經(jīng)上海生工測序全長1 529 bp，經(jīng)GENEBANK中BLAST比對與糞產(chǎn)堿菌相似性最高達98.5%，結(jié)合理化檢測結(jié)果判定為糞產(chǎn)堿菌。2JQ菌株系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

2.3 石油烴降解率測定石油烴降解過程中可見，2JQ在以石油烴為唯一碳源培養(yǎng)基中生長較好，培養(yǎng)液由澄清變?yōu)榛鞚?，說明2JQ可以利用上述5種石油烴的一種或幾種作為碳源進行生長。氣相色譜面積歸一法測定石油烴降解率，結(jié)果見圖4?？梢姡?JQ對5種烴的降解率分別為68.21%、64.70%、58.04%、49.73%、19.87%。隨石油烴碳含量增加，2JQ降解率逐漸降低。

2.4 耐鹽堿性研究結(jié)果由圖5可見，2JG 在pH 7～10的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長良好；在含NaCl為1%和2%的培養(yǎng)基中其最適pH均為9，平均OD值最高為0.287 6；pH為8和9時細菌生長速度明顯高于pH 7、10、11(P≤0.01)，在pH 11時幾乎不生長。細菌在NaCl含量為1%的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長速度略高于2%，差異不顯著(P≥0.05)。

3 結(jié)論與討論

獲得一株最適pH為9的耐鹽堿石油降解菌，7 d石油降解率為67.1%，石油烴正十二烷、正十四烷、正十六烷、正二十烷、正三十二烷降解率分別為68.21%、64.70%、58.04%、49.73%、19.87%。該菌可以在高鹽高堿情況下生長，對大慶地區(qū)鹽堿土壤石油降解具有非常重要的意義。

石油又稱原油，認為是古代海洋或湖泊中的生物經(jīng)過漫長的年代演化形成，成分復(fù)雜、顏色深、粘度大、極難降解。該研究從大慶地區(qū)石油污染土壤分離的糞產(chǎn)堿菌2JQ石油降解率為67.10%，5種石油烴中正十二烷的降解率最高，為68.21%，正三十二烷僅為19.87%?？梢姡摼鷮Ω咛纪闊N降解能力較低?，F(xiàn)在已有很多石油及石油烴生物降解的相關(guān)研究，如張潔從油田油泥中分離出4株降解菌，4株菌最高石油降解率為66.3%，最低為39.0%，4株菌對正十六烷降解率為90%左右，對其他烴降解率則較低[6]；劉明等分離出一株降解率46.9%的紅球紅平菌[7]。可見，單菌株對石油的降解率并不十分理想，這是由于石油成分非常復(fù)雜，包括鏈烷烴、環(huán)烷烴、多環(huán)芳香烴、非烴類化合物等[8]。而單個菌往往僅能對石油中的某些成分進行降解，其他成分則無能為力。因此，僅僅依靠一種菌完成所有化合物的分解幾乎是不可能的，需進一步進行菌群構(gòu)建等方面的研究。該研究中分離的糞產(chǎn)堿菌是一株耐鹽堿石油降解菌，對于惡劣環(huán)境有較強適應(yīng)能力。該菌的獲得對于大慶地區(qū)石油降解及菌群構(gòu)建的相關(guān)研究意義重大，有較高的實用價值。

[1] 王世杰，王翔，盧桂業(yè)，等.柴油降解茵的篩選鑒定及降解特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2011(30):49-54.

[2] 王金成，井明博，段春艷，等.黃土高原長慶油田高效石油降解菌篩選及其降解率的測定[J].隴東學院學報，2013(5):66-69.

[3] 雒曉芳，霍偉鵬，孫琦，等.石油降解菌株降油效果的比較研究[J].西北民族大學學報：自然科學版，2013(3):47-50.

[4] 田苗.石油降解菌的篩選及對石油污染土壤的修復(fù)實驗[D].西安：西北大學，2010.

[5] 李寶明，阮志勇，姜瑞波.石油降解菌的篩選、鑒定及菌群構(gòu)建[J].中國土壤與肥料，2007(3):68-72.

[6] 張潔.高效降解長慶石油污染物細菌系的篩選及其特性研究[D].西安：西北大學，2012.

[7] 劉明，孫鵬，張祥勝，等.原油降解菌YSL28的分離鑒定及降解特性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2013(5):47-50.

[8] 劉陽.印度洋表層海水石油降解菌及其烷烴羥化酶AlKB的多樣性分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2013.

Screening and Degradation Characteristics of Saline Alkali Tolerance Crude Oil Degrading Bacteria 2JQ

YANG Qing-li, DONG Yan, JI Yan-ru et al

(Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences, Daqing, Heilongjiang 163319)

A degrading bacteria named 2JQ was obtained in Daqing distinct crude oil pollution soil. It was confirmed to beAlcaligenesfaecalisthrough the method of 16SrDNA and physicochemical property. GC was used to test the degrading rate of crude oil and petroleum hydrocarbon C12H26, C14H30, C16H34, C20H40, C32H66. Results showed that degrading rate of crude oil was 67.1% and five hydrocarbons were 68.21%, 64.70%, 58.04%, 49.73% and 19.87%. 2JQ can grow fast in the condition of high concentration salt and alkali. It means that 2JQ can be used in Daqing saline alkali soil to reduce the crude oil pollution.

Crude oil degrading bacteria; Crude oil; Petroleum hydrocarbon; Degradation rate

黑龍江省科學院青年創(chuàng)新基金項目(CX13G01)。

楊慶麗(1977-)，女，黑龍江大慶人，助理研究員，碩士，從事生物環(huán)保方面研究。

2014-11-20

S 181.3;X 172

A

0517-6611(2015)01-234-02