熱研5號柱花草高頻、優(yōu)質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)

釧秀娟，陳彩虹，羅麗娟

(1.海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南 ?？?570228； 2.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228)

熱研5號柱花草高頻、優(yōu)質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)

釧秀娟1，陳彩虹1，羅麗娟2

(1.海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南 ?？?570228； 2.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228)

本研究按應(yīng)用正交試驗，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分析熱研5號柱花草(Stylosanthesguianensiscv. Reyan No.5)在誘導(dǎo)高頻、優(yōu)質(zhì)愈傷組織過程中激素6-BA、2,4-D濃度和外植體類型對誘導(dǎo)效果的影響。結(jié)果表明，6-BA是影響柱花草愈傷組織的誘導(dǎo)率以及褐化率的最主要因素，其次是2,4-D和外植體；柱花草愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2,4-D(0.2～0.5 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉，pH 5.8。子葉、真葉、下胚軸、生長點、上胚軸、根均能誘導(dǎo)愈傷組織，根的愈傷誘導(dǎo)率為80%，其余外植體的誘導(dǎo)率均在95%以上，下胚軸上段形成的愈傷組織芽的分化率高于其他外植體。

熱研5號柱花草；正交設(shè)計; 組織培養(yǎng)

柱花草(Stylosanthesspp.)是豆科(Leguminosae)多年生草本植物，為世界熱帶地區(qū)栽培及應(yīng)用最廣泛的牧草[1]。1962年，我國首次將其作為橡膠園的覆蓋作物引種到海南島[2]。目前，柱花草已被推廣種植到廣西、云南、貴州、福建及四川的攀枝花等干熱河谷地區(qū)[3]。但是低溫、病害、雜草等脅迫條件的存在仍是柱花草更好更廣泛利用的最大障礙[4]?？共∮N、提高產(chǎn)量、改善牧草營養(yǎng)品質(zhì)和利用率是利用生物技術(shù)進(jìn)行牧草品質(zhì)改良的重要目標(biāo)[5-6]。近年來國內(nèi)外在利用體細(xì)胞融合技術(shù)、基因工程技術(shù)獲得優(yōu)良牧草品種方面開展了多項工作[7-11]，其中利用基因工程技術(shù)把外源基因?qū)胫参镏幸垣@得優(yōu)良材料的方法具有廣闊的前景。

Scowcroft和Adamson[12]首次利用有鉤柱花草(S.hamata)的胚根和子葉為外植體，誘導(dǎo)分化出愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)，形成了具有根、莖、葉的完整小植株，成為了柱花草再生體系研究的標(biāo)志。國內(nèi)學(xué)者對柱花草再生體系的研究也做了一定的工作，但研究結(jié)果存在較大的差異，比如在激素的配合使用方面，有學(xué)者以熱研2號柱花草(S.guianensiscv. Reyan No.5 )為材料選取真葉為外植體誘導(dǎo)愈傷，得出激素的最適配比為MS+NAA 2.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1[13]，或者M(jìn)S+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 4.0 mg·L-1[14]。因此,對培養(yǎng)基參數(shù)和激素配比等進(jìn)行優(yōu)化來提高出愈率、叢生芽的分化率和生根率，以建立更高效更完整的柱花草再生體系方面仍值得進(jìn)一步研究。在前人的研究中所使用的激素主要是6-BA和NAA，但2,4-D對于豆科植物胚性愈傷的誘導(dǎo)也有極其重要的作用[15]。在研究苜蓿(Medicagosativa)再生體系的建立時，2,4-D是應(yīng)用最廣泛的生長素[16-18]。在柱花草研究中也有學(xué)者肯定了2,4-D的重要性[19]。此外外植體的選擇對愈傷組織誘導(dǎo)的成功與否是非常重要的，不同外植體誘導(dǎo)出愈傷的狀態(tài)大不相同，其質(zhì)量與后續(xù)的分化培養(yǎng)關(guān)系密切。

本研究以熱研5號柱花草為材料，以6-BA和2,4-D單因素試驗為基礎(chǔ)，采用正交設(shè)計法，選擇不同種類的外植體，觀察其芽分化的情況，旨在選出最優(yōu)質(zhì)的外植體，明確不同外植體、不同植物生長調(diào)節(jié)劑及不同濃度的組合對柱花草愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響，從而建立柱花草的高頻優(yōu)質(zhì)再生體系，并為遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料為熱研5號柱花草。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉，pH 5.8，培養(yǎng)條件為(28±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時間為12 h·d-1。

1.3 試驗方法

1.3.1 無菌苗的獲得 熱研5號柱花草種子磨去種皮，80 ℃ 熱水處理5 min，70%酒精浸泡5 min，無菌水沖洗3次，10%次氯酸鈉處理10 min，無菌水沖洗5次，種子置于無菌濾紙上吸干水分，接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)以獲得柱花草無菌苗。

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 在超凈工作臺上將苗齡7～8 d的柱花草子葉、真葉切成2 mm×2 mm大小，下胚軸切成5 mm長度的小段，分別接種到附加不同水平濃度的6-BA和2,4-D的MS培養(yǎng)基上。試驗采用三因素三水平試驗，正交表選用L27(313)正交表(表1、2)，其中A、B、C分別對應(yīng)6-BA、2,4-D和外植體類型，A因素的3個水平為0、1、2 mg·L-1，B因素的3個水平分別為0、0.2、0.5 mg·L-1，C因素分別對應(yīng)下胚軸、子葉、真葉。每個處理5個重復(fù)，每重復(fù)10個外植體，10 d繼代一次，繼代兩次后觀察出愈率、褐化率以及愈傷組織的色澤以及質(zhì)地。對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，分析采用JMP軟件進(jìn)行。確定A、B、C 3個因素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，選出最適的愈傷組織誘導(dǎo)激素配比。出愈率為長出愈傷的外植體數(shù)與接種塊數(shù)的比率，褐化率為褐化的外植體數(shù)所占接種外植體數(shù)的比率。

1.3.3 最佳外植體的選擇 分別以苗齡7～8 d的第一真葉、上胚軸、子葉、頂端生長點、下胚軸上段(近子葉一端)、下胚軸中段、下胚軸下段(近根一端)、根為外植體，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，待愈傷組織長出后將其接種到分化培養(yǎng)基(MS+6-BA 2.0 mg·L-1+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉,pH 5.8)上使其分化，6～7周后觀察記錄愈傷組織的分化情況，10 d繼代一次。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15外植體，褐化和污染不計。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素

下胚軸、子葉、真葉在接種4～5 d時，切口處出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，其中以下胚軸最為明顯。9～10 d時可見部分愈傷長出，培養(yǎng)18 d時已有大量愈傷形成，下胚軸的兩端膨大、呈不對稱的啞鈴狀，呈現(xiàn)形態(tài)學(xué)下部生長大于形態(tài)學(xué)上部的極性現(xiàn)象。外植體形成的愈傷組織從形態(tài)和質(zhì)地上可分為4種類型：1)淡黃色水漬狀,質(zhì)地疏松，水漬化，輕捏即可破碎；2)黃褐色疏松狀；3)綠色致密狀，表面有點狀突起屬于狀態(tài)相對較好的愈傷；4)淡綠色疏松狀(圖1)。 柱花草愈傷組織繼代后4～5 d，部分組合的少數(shù)外植體有不定芽生成；柱花草愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率與激素的使用密切相關(guān)(表3)。只有在添加激素的情況下柱花草外植體才能長出愈傷組織；使用兩種激素的情況下所誘導(dǎo)出的愈傷大部分呈現(xiàn)綠色致密狀態(tài)，且生長情況較好；當(dāng)6-BA為2.0 mg·L-1,2,4-D為0.2～0.5 mg·L-1時以及6-BA為1.0 mg·L-1,2,4-D為0.2～0.5 mg·L-1時,愈傷誘導(dǎo)率顯著高于其他處理組合(P<0.05)，且愈傷組織的生長狀態(tài)好，6-BA濃度為2.0 mg·L-1時愈傷組織誘導(dǎo)率較高，在出愈率較高的處理組合中,6-BA為2.0 mg·L-1、2,4-D為0.2 mg·L-1、外植體為子葉的處理的褐化率最低，與除A2B1C2外的其余A2處理組合差異不顯著(P>0.05)，但與A3處理組合差異顯著。

A因素的極差最大(表4)，C、B因素次之，由此得出3個因素中6-BA對柱花草愈傷組織誘導(dǎo)的影響最大，其次是外植體,2,4-D的影響相對較小。柱花草愈傷組織誘導(dǎo)率試驗結(jié)果的方差分析(表5)表明，6-BA、2,4-D及二者的互作對柱花草愈傷組織誘導(dǎo)率的影響均有極顯著影響(P<0.01)。

柱花草愈傷組織褐化率試驗結(jié)果的方差分析(表6)表明，A、A×B、A×C因素對愈傷組織褐化率的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)。A因素的極差大于B、C因素，所以參試的3個因素中6-BA對愈傷組織褐化率的影響最大(表7)。

綜合愈傷色澤狀態(tài)、生長情況、愈傷誘導(dǎo)率、褐化率以及統(tǒng)計分析結(jié)果可知，愈傷組織誘導(dǎo)最優(yōu)配比組合為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2,4-D (0.2～0.5 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉,pH值5.8。

注：Ⅰ,淡黃色水漬狀愈傷；Ⅱ,黃褐色疏松狀愈傷；Ⅲ,綠色緊實狀愈傷；Ⅳ,淡綠色疏松狀愈傷。

Note：Ⅰ, pale yellow and watery； Ⅱ, tawny and loosened； Ⅲ , dark green and compact； Ⅳ, green and loosened.

注：“+”表示生長的強(qiáng)弱，越多表示長勢越好；同列不同小寫字母表示不同處理組合間差異顯著(P<0.05)。

Note：“+” in the table means the growing status, more “+” indicates stronger vigorous growth; Different lower case letters within same column mean significant difference among different test treatment at 0.05 level.

注：**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：** mean significant difference at 0.01 level.

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

Note：* mean significant difference at 0.05 level.

2.2 外植體的選擇

不同外植體均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但出愈率和芽分化率有所不同。子葉、真葉、下胚軸、上胚軸、生長點的出愈率均在95%以上，愈傷狀態(tài)以下胚軸上段最好，呈綠色緊實狀，且表面有許多類似芽點的點狀突起，第一真葉、生長點、下胚軸中段次之，此類外植體誘導(dǎo)的愈傷疏密度適中，與下胚軸上段相比表面的點狀突起相對較少。根部的愈傷誘導(dǎo)率相對較低,僅有80%，且愈傷組織多數(shù)呈現(xiàn)疏松狀態(tài)，近根部的下胚軸所誘導(dǎo)的愈傷與根部相似。繼代培養(yǎng)一次后接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上12～13 d時開始出現(xiàn)分化。各類外植體分化情況表明(圖2)，近子葉端的下胚軸出芽率最高，第一真葉次之，根的出芽率最低，頂端生長點、下胚軸中段和上胚軸的出芽率差別不大，選取下胚軸上段(近子葉一端)為最佳外植體。

注：A，真葉；B，子葉；C，生長點；D，根；E，下胚軸上段；F，下胚軸中段；G，下胚軸下段；H，上胚軸； 不同小寫字母表示不同外植體之間差異顯著(P<0.05)。

Note：A.euphylla, B.cotyledon, C.the growing point, D.root, E.the upper hypocotyl, F.the middle of hypocotyl, G.the last hypocotyl, H.epicotyl; Different lower case letters show significant difference among different explants at 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑用量雖然微小，但不可缺少。使用不同種類、不同濃度和不同比例關(guān)系的植物生長調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的生長發(fā)育進(jìn)程、分化方向和器官發(fā)生[19]。正交試驗不僅能分析各個因子的影響情況，還能體現(xiàn)出因素之間是否存在交互作用。本研究采用正交試驗研究了6-BA、2,4-D和外植體對柱花草愈傷組織誘導(dǎo)的影響得出，6-BA是影響柱花草愈傷組織誘導(dǎo)率以及褐化率的最主要因素，其次是2,4-D和外植體，柱花草愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg·L-1+2,4-D(0.2～0.5 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉,pH 5.8,本研究還發(fā)現(xiàn)柱花草愈傷組織的誘導(dǎo)率還與6-BA與2,4-D互作有關(guān)。有研究得出，在生長素和細(xì)胞分裂素配合使用的情況下，愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于單獨附加其中一種激素[13]，在本試驗中也得到證明。國外學(xué)者研究了NAA和6-BA對柱花草的愈傷組織形成使用比例[20]，但沒有對誘導(dǎo)率和試驗結(jié)果統(tǒng)計分析，對于柱花草愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素尚不明確。本試驗明確了影響熱研5號柱花草愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素。

有研究表明不同類型外植體在同一培養(yǎng)基上，其分化情況有較大差異[18]。本試驗使用不同的外植體觀察愈傷分化情況，結(jié)果表明，近子葉端的下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷分化率最高，第一真葉次之，根的出芽率最低，頂端生長點、下胚軸中段和上胚軸的分化率差別不大。出現(xiàn)此情況可能是因為下胚軸屬于胚性器官，細(xì)胞生長分裂能力較為旺盛。有學(xué)者以熱研2號柱花草的真葉、剛展開的子葉為外植體進(jìn)行試驗，得出真葉的出愈率最高為89.5%，分化系數(shù)最高為10.27，選其為最佳外植體[21]。此外,在柱花草組織培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的分化還與愈傷組織的狀態(tài)存在很大關(guān)系，綠色致密型且表面點狀突起較多的愈傷團(tuán)芽分化能力強(qiáng)于表面點狀突起較少的愈傷[22]。本研究結(jié)果可為柱花草愈傷組織誘導(dǎo)中培養(yǎng)基的配比和外植體的選擇提供幫助。

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(責(zé)任編輯 王芳)

2014年12月國際市場主要飼料與畜產(chǎn)品價格分析

12月國際飼料價格跌漲互現(xiàn)，國際畜產(chǎn)品價格繼續(xù)呈現(xiàn)下降趨勢。

一、玉米、大豆、高梁、苜蓿粉、棉籽餅、豆粉市場價格上漲，菜籽、豆粕市場價格下降

12月份玉米、大豆、高梁、苜蓿粉、棉籽餅、豆粉市場平均價格分別為156.99、379.68、152.29、284.38、368.00、412.20美元·t-1,環(huán)比分別上漲6.8%、0.1%、8.6%、3.4%、5.2%、1.1%。菜籽、豆粕市場平均價格為402.10、378.24美元·t-1,環(huán)比分別下降0.7%、1.5%。

二、豬肉、牛奶、瘦肉豬、育肥牛、羊羔肉、羊肉、牛肉市場價格繼續(xù)下降，雞肉市場價格連續(xù)3個月平穩(wěn)

12月份豬肉、牛奶、瘦肉豬、育肥牛、羊羔肉、羊肉、牛肉市場平均價格分別為1.81、0.33、1.81、4.84、3.57、2.19、5.67美元·kg-1,環(huán)比分別下降2.3%、8.8%、8.9%、7.3%、8.9%、6.9%、8.0%。雞肉市場價格為2.51美元·kg-1，連續(xù)3個月平穩(wěn)。

數(shù)據(jù)來源：國際市場商品價格網(wǎng) http://price.mofcom.gov.cn/；中國農(nóng)業(yè)信息網(wǎng) http://www.agri.gov.cn/；雞肉 http://www.indexmundi.com/；羊羔肉、羊肉 http://www.interest.co.nz/rural；牛肉http://www.thebeefsite.com/；豬肉 http://www.thepigsite.com/；貨幣匯率：http://qq.ip138.com/hl.asp。

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 王迎新 整理)

Callus induction ofStylosanthesguianensiscv. Reyan No.5

CHUAN Xiu-juan1, CHEN Cai-hong1, LUO Li-juan2

(1.College of Horticulture and Landscapes, Hainan University, Haikou 570228, China; 2.College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China)

Effects of hormones 6-BA and 2,4-D and different explants on callus induction ofStylosanthesguianensiscv. Reyan No.5 were studied by orthogonal design statistic analysis. The results indicated that the main factor which influenced callus induction was 6-BA and the optimal medium for callus induction was MS medium with 2.0 mg·L-16-BA and 0.2～0.5 mg·L-12,4-D. All the explants using in the study included cotyledon, euphylla, hypocotyl, the growing point tissue, epicotyl, root, respectively could induce callus. The callus inducing rate of the explants were 95% except with that root was 80%. The budding rate of the callus from the upper hypocotyl was significantly higher than the callus from the other explants.

Stylosanthesguianensiscv. Reyan No.5; orthogonal design; tissue culture

LUO Li-juan E-mail：Luolj@123.com

2014-03-12 接受日期：2014-05-20

國家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系熱帶牧草育種(CARS-35-03)

釧秀娟(1989-)，女，云南保山人，在讀碩士生，研究方向為植物遺傳轉(zhuǎn)化。E-mail：504470504@qq.com

羅麗娟(1964-)，女，云南元謀人，教授，博士，研究方向為熱帶作物(木薯、熱帶牧草)的發(fā)育生物學(xué)、種質(zhì)資源與遺傳育種。E-mail：Luolj@123.com

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0107

Q943.1

A

1001-0629(2015)01-0078-07

釧秀娟,陳彩虹,羅麗娟.熱研5號柱花草高頻、優(yōu)質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)[J].草業(yè)科學(xué)，2015,32(1)：78-84.

CHUAN Xiu-juan,CHEN Cai-hong,LUO Li-juan.Callus induction ofStylosanthesguianensiscv. Reyan No.5[J].Pratacultural Science，2015,32(1)：78-84.